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4070
Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate)
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Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) #4070

引用 (26)
筛选器：
  1. IP
Immunoprecipitation Image 1: Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate)
使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate)（泳道 3 和 4）对未经处理或已经 PDGF 处理的 NIH/3T3 细胞的提取物进行免疫沉淀。XP® Rabbit IgG (DA1E) mAb Isotype Control (Sepharose® Bead Conjugate) #3423 用作阴性对照（泳道 1 和 2）。使用 Phospho-Akt (Ser473) (587F11) Mouse mAb #4051 检测蛋白质印迹。
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4070S		 400 µl

定制制剂

支持性数据

反应性 H M R Hm Mk Dm Z B
灵敏度 内源性
MW (kDa) 60
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology (CST) 的这种抗体通过共价结合伯胺基团固定到 N-羟基丁二酰亚胺 (NHS) 激活的 Sepharose® 微珠上。Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) 可用于进行免疫沉淀检测。非偶联 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060 会与人、小鼠、大鼠、仓鼠、果蝇、牛和斑马鱼的磷酸化 Akt 蛋白发生反应。CST 预计 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) 还可识别这些物种中的磷酸化 Akt。
MW (kDa) 60

产品使用信息

应用 稀释度
免疫沉淀法 1:20

保存

存储在 10 mM HEPES 钠 (pH 为 7.5 )，150 mM NaCl、100 µg/ml BSA，50 % 甘油中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。

实验步骤

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用于蛋白免疫印迹分析的免疫沉淀法

本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法，进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。

A. 溶液与试剂

注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808)。

  2. 10X 细胞裂解缓冲液： (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5)，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM EGTA，1% Triton X-100，2.5 mM 焦磷酸钠，1 mM β 甘油磷酸酯，1 mM Na3VO4，1 μg/ml 亮抑酶肽

    注意： CST 建议在使用前应添加 1 mM PMSF (#8553)*。

  1. 3X SDS 样品缓冲液： (#7722) 187.5 mM Tris-HCl（pH 6.8，25°C），6% w/v SDS，30% 甘油，150 mM DTT，0.03% w/v 溴酚蓝
  2. 10X 激酶缓冲液（用于激酶试验）：(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  3. ATP (10 mM)（用于激酶试验）：(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM)，将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞，并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上可对样品进行 3 次超声粉碎，每次 5秒。
  6. 在 4°C，14,000 x g 条件下，离心 10 分钟，将上清转移到新管中。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

  1. 取出​200 μl 细胞裂解液，然后添加10 μl 的 固定抗体，并在4°C旋转孵育过夜。
  2. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，同时洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
  3. 继续使用蛋白质印迹法或激酶活性分析对进行样品分析（D 部分）。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 对于 SDS-PAGE，将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注意：当使用兔源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）作为二抗，以尽量减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127），以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。

当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗，以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。

用激酶活性测定法进行分析

  1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

发布​时间 2007 年 12 月

修订时间 2021 年 10 月

实验步骤编号：27

特异性/灵敏度

仅当 Akt 在 Ser473 位点被磷酸化时，Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) 才能检测出内源水平的 Akt 。

物种反应性：

人, 小鼠, 大鼠, 仓鼠 , 猴, 黑腹果蝇 , 斑马鱼 , 牛

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种：

鸡 , 非洲爪蟾蜍, 犬 , 猪

来源/纯化

使用与人 Akt 的 Ser473 周围残基相对应的合成磷酸肽，对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

Akt 也称作 PKB 或 Rac，在控制细胞存活和凋亡中发挥至关重要作用 (1-3)。这种蛋白激酶由胰岛素和多种生长和存活因子激活，并在涉及 PI3 激酶的 wortmannin 敏感通路中发挥作用 (2,3)。通过磷脂结合过程并由 PDK1 在 Thr308 位点磷酸化激活环 (4) ，以及通过羧基末端内部 Ser473 处的磷酸化激活 Akt。曾经功能难以捉摸的 PDK2 可在 Ser473 处磷酸化 Akt ，它被鉴定为在含 rictor 和 Sin1 的雷帕霉素中的非敏感复合体中哺乳动物雷帕霉素靶标 (mTOR) (5,6)。Akt 通过磷酸化和失活几种靶标（包括 Bad (7)、叉头转录因子 (8)、c-Raf (9) 和 caspase-9）而抑制凋亡，进而促进细胞存活。PTEN 磷酸酶是 PI3K/Akt 信号转导通路的主要负向调节分子 (10)。LY294002 是特异性 PI3 激酶抑制剂 (11)。Akt 的另一个主要功能是通过磷酸化和失活 GSK-3α 和 β 调节糖原合成 (12,13)。Akt 还可以在胰岛素刺激转运葡萄糖中发挥作用 (12)。除其在存活和糖原合成中的作用外，Akt 还通过防止 GSK-3β 介导的磷酸化和周期蛋白 D1 降解 (14) 并通过负向调节周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白 p27 Kip1 (15) 和 p21 Waf1/Cip1 (16) 来参与细胞周期调节。Akt 还通过直接磷酸化含有 raptor 的雷帕霉素敏感性复合体中的 mTOR，在细胞生长中发挥至关重要作用 (17)。更重要的是，Akt 磷酸化并失活结节蛋白 (TSC2)（在 mTOR-raptor 复合体中 mTOR 的抑制分子）(18,19)。

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  19. Manning, B.D. et al. (2002) Mol Cell 10, 151-62.

通路

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