CD3ε (D7A6E^™) & C0-0001-488 SignalStar^™ Oligo-Antibody Pair #92856

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。 对于每个荧光信道，成像轮次可以含有仅 1 种互补性性寡核苷酸。切勿在相同成像轮次合并相同荧光信道专属的互补性寡核苷酸，因为这会使分析结果不可解读。

切勿合并来自不同检验组合的抗体。 如果您同时运行多个检验组合，则必须为每个检验组合生成单独的抗体/互补性寡核苷酸混合物。

在创建溶液之前，使用 BOND RX 软件设置实验步骤和试剂。 创建容器、实验步骤和新的 BOND 研究检测系统。需要 BOND 研究检测系统才能运行此实验步骤。

执行每轮 SignalStar 检测后，始终对 BOND RX 进行吸液探针清洁。

请确认您的 SignalStar 检验组合设计是否要求 2 轮成像。 利用本文档第 10.1 节和第 9.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

确认您的显微镜可以检出此试剂盒提供的荧光团。 成像时，除 DAPI 外，还存在 4 个需要采集的荧光信道。

建议应通过将单张染色的载玻片对上述光谱成像，创建光谱库。 这将使得更好解混成为可能，以帮助最大限度降低光谱渗透的可能性。

建议使用 DAPI 浓缩物，而不是含 DAPI 的封固剂。 DAPI 亮染便利更好地对齐图像。

如果溶液未充分混合，荧光信号可能变动或减弱。 使用前，将每种试剂以 1,000 rpm 的速度旋转 30 秒，然后通过吸取缓慢混匀。 使用试剂时，缓慢移液以确保准确度。不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后，应立即使用 SignalStar 溶液。

载玻片最好应在完成染色的 8 小时以内成像。 如果载玻片未在这个时间段以内成像，则荧光信号可能减弱。

如果对本实验步骤有任何偏离，则结果得不到保证。 SignalStar 实验步骤用指定的抗原修复步骤和染色步骤制定并优化。

建议使用阳性对照载玻片。 每次运行中应纳入一种组织，其中显色性染色已经对该组织确认多重检验组合中存在所有靶标。

建议应按 1:100 使用每种抗体。 但是，供应了足够的抗体试剂以便按 1:50 或 1:200 稀释度使用。

在创建溶液之前，使用 BOND RX 软件设置实验步骤和试剂。需要 BOND RX 软件版本 7.0 或更高版本。

1. MARKER（= SignalStar 染色溶液）

2. SignalStar 放大液 1

3. SignalStar 放大液 2

4. SignalStar 连接溶液

5. SignalStar 荧光移除液

6. 10% 中性缓冲福尔马林

创建 10% 中性缓冲福尔马林试剂时选择“危险”，以确保废物得到妥善处理。

7. 0.1X TBST

8. 1X TBST（连接 BOND 研究检测系统所需）

1. 创建一个名为“CST SignalStar”的新 BOND 研究检测系统。

2. 将带有 1X TBST 的 30 mL 开放式容器连接至 CST SignalStar BOND 研究检测系统。

步骤 2 中的开放式容器必须明确命名（例如，“1X TBST”而不是“0.1X TBST”）。

1. 在 BOND RX 软件中，选择“实验步骤设置”选项卡。

2. 选择“*IF 实验步骤”（确保“修改者”列中列出的是 Leica）。

3. 复制实验步骤并将其重命名为“CST SignalStar 第 1 轮成像”。添加缩写名称“CST Rd1”。

4. 选择“显示清洗步骤”。

6. 选择“CST SignalStar”作为首选检测系统。

7. 选择“创建实验步骤”。

8. 单击“保存”，然后单击“是”以确认警告消息。

9. 创建“CST SignalStar 第 1 轮成像”实验步骤的副本。

10. 将副本名称更改为“CST SignalStar 第 2 轮成像”，其缩写为“CST Rd2”。

11. 选择“显示清洗步骤”。

13. 选择“CST SignalStar”作为首选检测系统。

14. 选择“创建实验步骤”。

15. 单击“保存”，然后单击“是”以确认警告消息。

必须在适当的 BOND RX 容器中或 BOND 滴定套件 (#OPT9049) 的插管中使用每种试剂，以便检测正常运行。 请参阅下表，以了解在 BOND RX 自动染色机上执行 SignalStar 检测所需的容器或插管的数量。

请勿将打开的容器装得过满。如果容器装得太满，BOND RX 自动染色机将认为容器是“空的”。

一旦配制，SignalStar 第 1 轮成像液应包含随试剂盒（包括用于第 1 轮成像和第 2 轮成像的抗体）订购的所有抗体（最多 8 种）以及用于第 1 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 10.1 节和第 9.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移入 BOND 6 mL 滴定插管，以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后，应立即使用 SignalStar 溶液。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移入 BOND 6 mL 滴定插管，以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后，应立即使用 SignalStar 溶液。

对于 10 张载玻片运行，在锥形管中补充总体积，旋转 20 分钟，然后在 2 个滴定插管之间均匀分配。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移入 BOND 6 mL 滴定插管，以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后，应立即使用 SignalStar 溶液。

对于 10 张载玻片运行，在锥形管中补充总体积，旋转 20 分钟，然后在 2 个滴定插管之间均匀分配。

将以下试剂合并到一个 BOND 滴定插管中。用护膜覆盖并涡旋 10 秒。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后，应立即使用 SignalStar 溶液。

• 含 Tween 20 (TBST) 的 0.1X Tris 盐缓冲液 (TBST)：要制备 500 mL 1X TBST，添加 5 mL Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 至 495 ml dH₂O 中。装满 30 mL BOND 开放式容器（2 个容器用于 5 张载玻片，3 个容器用于 10 张载玻片）。避免在制备过程中产生气泡。
• 含 Tween 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液 (TBST)：要制备 500 mL 1X TBST，添加 50 mL Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 至 450 ml dH₂O 中。装满 30 mL BOND 开放式容器（1 个容器用于 5 张或 10 张载玻片）。避免在制备过程中产生气泡。
• 10% 中性缓冲福尔马林：在实验室通风橱中，装满 7 mL BOND 开放式容器。

可以在您开始实验前当天烘干载玻片。这个步骤允许固体石腊熔化。

1. 载玻片制备：脱蜡
2. 分装量：150 μL
3. HIER：ER2 40 分钟

最好确认第 1 轮成像实验步骤中的每个步骤都正确无误。 请使用第 9.2 节中的清单，以协助创建您的实验步骤。

确保下面列出的所选 0.1X TBST 清洗设置为“打开”。 如果不“打开”清洗，则荧光信号可能会变动或减弱。确认总共有 6 个 SignalStar 放大液 1 步骤和 6 个 SignalStar 放大液 2 步骤。

确认散装 Bond 洗涤液容器已装满，且废物容器为空。

立即启动运行 BOND RX 染色，请勿使用延迟启动。染色完成后，载玻片可以在 BOND RX 自动染色机上放置过夜。

一旦载玻片脱蜡或取下盖玻片，任何时候切勿让它们干透。

必须在适当的 BOND RX 容器中或 BOND 滴定套件 (#OPT9049) 的插管中使用每种试剂，以便检测正常运行。 请参阅下表，以了解在 BOND RX 自动染色机上执行 SignalStar 检测所需的容器或插管的数量。

请勿将打开的容器装得过满。如果容器装得太满，BOND RX 自动染色机将认为容器是“空的”。

一旦配制，SignalStar 第 2 轮成像液应仅包含用于第 2 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 10.1 节和第 9.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移入 BOND 6 mL 滴定插管，以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后，应立即使用 SignalStar 溶液。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移入 BOND 6 mL 滴定插管，以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后，应立即使用 SignalStar 溶液。

对于 10 张载玻片运行，在锥形管中补充总体积，旋转 20 分钟，然后在 2 个滴定插管之间均匀分配。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移入 BOND 6 mL 滴定插管，以确保准确度并避免产生任何气泡。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后，应立即使用 SignalStar 溶液。

对于 10 张载玻片运行，在锥形管中补充总体积，旋转 20 分钟，然后在 2 个滴定插管之间均匀分配。

在 1 个 BOND 滴定插管中混合以下试剂。用护膜覆盖并涡旋 10 秒。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后，应立即使用 SignalStar 溶液。

在 1 个 BOND 滴定插管中混合以下试剂。用护膜覆盖并涡旋 10 秒。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。所有试剂混合用于运行后，应立即使用 SignalStar 溶液。

• 含 Tween 20 (TBST) 的 0.1X Tris 盐缓冲液 (TBST)：要制备 500 mL 1X TBST，添加 5 mL Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 至 495 ml dH₂O 中。装满 30 mL BOND 开放式容器（2 个容器用于 5 张载玻片，3 个容器用于 10 张载玻片）。避免在制备过程中产生气泡。
• 含 Tween 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液 (TBST)：要制备 500 mL 1X TBST，添加 50 mL Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997 至 450 ml dH₂O 中。装满 30 mL BOND 开放式容器（1 个容器用于 5 张或 10 张载玻片）。避免在制备过程中产生气泡。
• 10% 中性缓冲福尔马林：在实验室通风橱中，装满 7 mL BOND 开放式容器。

一旦载玻片脱蜡或取下盖玻片，任何时候切勿让它们干透。

1. 载玻片制备：--（无值/不需要）
2. 分装量：150 μL
3. HIER：--（无值/不需要）

重要提示：第 2 轮放大无需脱蜡和 HIER（抗原修复）。如果使用脱蜡和 HIER，第 2 轮放大结果将不可解读。

最好确认第 2 轮成像实验步骤中的每个步骤都正确无误。 请使用第 9.3 节中的清单，以协助创建您的实验步骤。

确保下面列出的所选 0.1X TBST 清洗设置为“打开”。如果不“打开”清洗，则荧光信号可能会变动或减弱。确认总共有 6 个 SignalStar 放大液 1 步骤和 6 个 SignalStar 放大液 2 步骤。

确认散装 Bond 洗涤液容器已装满，且废物容器为空。

立即启动运行 BOND RX 染色，请勿使用延迟启动。染色完成后，载玻片可以在 BOND RX 自动染色机上放置过夜。

一旦载玻片脱蜡或取下盖玻片，任何时候切勿让它们干透。

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。 对于每个荧光信道，成像轮次可以含有仅 1 种互补性性寡核苷酸。切勿在相同成像轮次合并相同荧光信道专属的互补性寡核苷酸，因为这会使分析结果不可解读。

切勿合并来自不同检验组合的抗体。 如果您同时运行多个检验组合，则必须为每个检验组合生成单独的抗体/互补性寡核苷酸混合物。

请确认您的 SignalStar 检验组合设计是否要求 2 轮成像。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

确认您的显微镜可以检出此试剂盒提供的荧光团。 成像时，除 DAPI 外，还存在 4 个需要采集的荧光信道。

建议应通过将单张染色的载玻片对上述光谱成像，创建光谱库。 这将使得更好解混成为可能，以帮助最大限度降低光谱渗透的可能性。

建议使用 DAPI 浓缩物，而不是含 DAPI 的封固剂。 DAPI 亮染便利更好地对齐图像。

如果溶液未充分混合，荧光信号可能变动或减弱。 使用低吸附移液器吸头合并 SignalStar 试剂盒所有组分，并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。 不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

载玻片最好应在完成染色的 12 小时以内成像。 如果载玻片未在这个时间段以内成像，则荧光信号可能减弱。

如果对本实验步骤有任何偏离，则结果得不到保证。 SignalStar 实验步骤用指定的抗原修复步骤和染色步骤制定并优化。

建议使用阳性对照载玻片。 每次运行中应纳入一种组织，其中显色性染色已经对该组织确认多重检验组合中存在所有靶标。

建议应按 1:100 使用每种抗体。 但是，供应了足够的抗体试剂以便按 1:50 或 1:200 稀释度使用。

在整个染色过程中，尽可能沥干孵育液和 dH₂O，同时不允许载玻片干透。 在每个步骤之后，从每张载玻片彻底拂去液体，然后继续下一个步骤。

一旦配制，SignalStar 第 1 轮成像液应包含随试剂盒（包括用于第 1 轮成像和第 2 轮成像的抗体）订购的所有抗体（最多 8 种）以及用于第 1 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

可以在您开始实验前当天烘干载玻片。 这个步骤允许固体石腊熔化。

1. 在 60°C 孵育载玻片 30 分钟。

一旦载玻片脱蜡，任何时候切勿让它们干透。加湿的孵育箱用于所有孵育步骤。确保每种溶液覆盖整个组织。

2. 在二甲苯洗液中孵育切片 3 次，每次 5 分钟。

3. 在 100% 乙醇洗液中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。

4. 在 95% 乙醇洗液中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。

5. 用 dH₂O 中清洗切片 2 次，每次 5 分钟。

建议在高压锅中进行 EDTA 抗原修复，以最大限度修复表位。本实验步骤描述了对 Biocare Medical Decloaking Chamber #DC2012 建议的条件。设备专用设置和操作说明应用于其它加压蒸煮器。

7. 将 500 ml dH₂O 倒入加压蒸煮器中。

8. 将切片夹放入加压蒸煮器，直至接触到隔热板。用载玻片容器盖部分盖住。

可能有利的是，将第二个以 250 mL 水和空白载玻片填充的 24 位载玻片架置入高压锅并用盖子部分盖住。

9. 密封蒸煮器室，并继续进行修复。以下为 Biocare Medical Decloaking Chamber #DC2012 的设置：

1. SP1 125°C 持续 30 秒
2. SP2 90°C 持续 10 秒

10. 小心使设备通气，随后取下盖子。

11. 从去掩蔽室取出载玻片，允许在实验台上冷却 10 分钟。

13. 将载玻片在 150 μL SignalStar 第 1 轮成像液中室温孵育 40 分钟。

或者，可以将载玻片在 SignalStar 第 1 轮成像液中 4°C 孵育过夜，以便将实验步骤分成多天进行。

14. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 1X TBST 中 30 秒。

15. 将载玻片在 10% 中性缓冲福尔马林中室温孵育 5 分钟。

16. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

1. 将载玻片在 150 μL 放大液 1 中孵育 8 分钟。
2. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。
3. 将载玻片在 150 μL 放大液 2 中孵育 8 分钟。
4. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

18. 将载玻片在 150 μL SignalStar 连接缓冲液中室温孵育 20 分钟。

19. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

20. 根据数据表说明，配制 DAPI #4083 溶液。

21. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。

22. 用 DAPI 溶液复染。

23. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。

24. 将载玻片用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 封固。

25. 尽快对载玻片成像。信号应保持稳定长达 8 小时。

SIGNALSTAR 第 2 轮成像仅为要求两个成像轮次的抗体检验组合所需。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

一旦配制，SignalStar 第 2 轮成像液应仅包含用于第 2 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

不向 SIGNALSTAR 第 2 轮成像液添加抗体-寡核苷酸偶联物。

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

使用低吸附移液器吸头配制溶液并在室温上下颠倒转动 20 分钟。缓慢移液以确保准确度。配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存于冰上。一旦合并，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

SIGNALSTAR 第 2 轮成像仅为要求两个成像轮次的抗体检验组合所需。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

一旦成像完成，就可以从载玻片移除荧光信号，从而可以进行另一轮成像。在第一轮成像后尽快执行下一组步骤。

1. 采集图像后，将载玻片浸泡于 dH₂O 中 ≥30 分钟，以轻柔取下盖玻片而不损坏组织。

2. 将载玻片在 150 μL SignalStar 荧光移除液中 37°C 孵育 2 小时。

3. 将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。

4. 可选：

1. 将载玻片封固在 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 with DAPI #4083 中，并对载玻片成像以确认无荧光信号余留。
2. 将载玻片浸泡于 dH₂O 中 ≥30 分钟，以轻柔取下盖玻片而不损坏组织。
3. 将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。

5. 将载玻片在 150 μL SignalStar 第 2 轮成像液中室温孵育 40 分钟。

6. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

1. 将载玻片在 150 μL 放大液 1 中孵育 8 分钟。
2. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。
3. 将载玻片在 150 μL 放大液 2 中孵育 8 分钟。
4. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

8. 将载玻片在 150 μL SignalStar 连接缓冲液中室温孵育 20 分钟。

9. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

10. 根据数据表说明，配制 DAPI #4083 溶液。

11. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。

12. 用 DAPI 溶液复染。

13. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。

14. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

15. 将载玻片用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 封固。

16. 尽快对载玻片成像。信号应保持稳定长达 8 小时。