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68344
SARS-CoV-1/2 Nucleocapsid Protein (1C7C7) Mouse mAb
一抗
单克隆抗体

SARS-CoV-1/2 Nucleocapsid Protein (1C7C7) Mouse mAb #68344

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Western Blotting Image 1: SARS-CoV-1/2 Nucleocapsid Protein (1C7C7) Mouse mAb

使用 SARS-CoV-1/2 Nucleocapsid Protein (1C7C7) Mouse mAb(上图)、DYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAb #14793(中图)和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图)对转染空载或瞬时转染带 Myc/DDK 标记的 SARS-CoV-2 核衣壳(N)蛋白(泳道 2)的 293T 细胞、模拟感染的 Vero-E6 细胞(泳道 3)、SARS-CoV-2 感染 Vero-E6 细胞(泳道 4)和分离的 SARS-CoV-2 病毒(泳道 5)的提取物进行蛋白质印迹分析。SARS-CoV-2 病毒体和 Vero-E6 细胞由波士顿大学国家新兴传染病实验室 Mohsan Saeed 博士友情提供。

Immunofluorescence Image 1: SARS-CoV-1/2 Nucleocapsid Protein (1C7C7) Mouse mAb

使用 SARS-CoV-1/2 Nucleocapsid Protein (1C7C7) Mouse mAb(绿色)、DyLight™ 554 Phalloidin #13054(红色)和 DAPI #4083(蓝色)对稳定表达 SARS-CoV-2 核衣壳(N)蛋白(A549-N 蛋白)(左图,阳性)或 SARS-CoV-2 膜衣壳(E)蛋白(A549-E 蛋白)(右图,阴性)的转基因 A549 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。转基因 A549 细胞由 Weill Cornell Medicine 的 Elena Piskounova 博士友情提供。

Immunofluorescence Image 2: SARS-CoV-1/2 Nucleocapsid Protein (1C7C7) Mouse mAb

使用 SARS-CoV-1/2 Nucleocapsid Protein (1C7C7) Mouse mAb(绿色)、DyLight™ 554 Phalloidin #13054(红色)和 DAPI #4083(蓝色)对瞬时转染带 SARS-CoV-2 核衣壳(N)蛋白的 293T 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。

购买 # 68344S
产品货号 规格 价格 库存
68344S
100 µl

支持数据

反应性 Vir
敏感性 内源性
MW (kDa) 55
来源/亚型 小鼠 IgG2a

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:200 - 1:800

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。不要分装抗体。‭

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗:Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (#7076)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(#7076,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody(#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育并伴有轻轻摇晃,在室温下孵育 1 小时,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:19

免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液和试剂

若想获得高质量的免疫荧光图片,请使用我们 #12727 Immunofluorescence Application Solutions Kit 中高效且划算的预制试剂。

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭缓冲液:(1X PBS / 5% 常规血清/ 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 Normal Goat Serum (#5425) 添加至 9 ml 1X PBS)并充分混合。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液: (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (#9998),并混合。
  5. 建议使用荧光物质标记的 Anti-Mouse 二抗:

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。

    注意:甲醛有毒性,需在通风橱中使用。

  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时,按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ,用盖玻片盖住切片。
  9. 要达到最佳效果,使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2013 年 11 月

实验步骤编号:148

特异性/敏感性

SARS-CoV-1/2 Nucleocapsid Protein (1C7C7) Mouse mAb 可识别 SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2 的核衣壳(N)总蛋白的内源水平。

物种反应性:

病毒

来源/纯化

使用对应 SARS-CoV-2 核衣壳(N)蛋白的重组蛋白对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

COVID-19 疫情的病因是一种新型的高致病性冠状病毒,称为 SARS-CoV-2(严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2)。SARS-CoV-2 是冠状病毒家族的成员(1)。SARS-CoV-2的基因组相对较大,最多可编码 29 个开放阅读框(ORF)。其中包括 ORF1a 和 ORF1b(进一步加工成16非结构蛋白),9辅助蛋白和4规范结构蛋白:刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白( N)(2)。核衣壳 (N) 蛋白是一种磷蛋白,在病毒组合中起关键作用(3,4)。它与病毒基因组 RNA 结合,使其能够包装到核糖核蛋白复合物(RNP)中,并且是病毒体中最丰富的蛋白质(5)。SARS-CoV-2 和其他冠状病毒研究的证据表明,核衣壳 (N) 蛋白的功能超出了病毒 RNA 的包装,包括在病毒复制(6)和抑制宿主对病毒感染的免疫反应中发挥作用(7)。

  1. Zhou, P. et al. (2020) Nature 579, 270-3.
  2. Tortorici, M.A. and Veesler, D. (2019) Adv Virus Res 105, 93-116.
  3. Zengel, J. et al. (2015) J Virol 89, 7338-47.
  4. Surjit, M. et al. (2005) J Virol 79, 11476-86.
  5. Peng, Y. et al. (2020) EMBO J, e105938.
  6. Cong, Y. et al. (2020) J Virol 94, e01925-19. doi: 10.1128/JVI.01925-19.
  7. Mu, J. et al. (2020) Sci China Life Sci 63, 1-4.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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