产品货号 | 规格 | 价格 | 库存 |
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2629S | 100 µl |
为庆祝中国农历新年,我们的中国办事处关闭。我们将于星期四(2 月 18 日 )开放。
感谢您的耐心等待。
反应性 | H M R Mk |
敏感性 | 内源性 |
MW (kDa) | 250 |
来源/亚型 | 小鼠 IgG1 |
产品信息
为了获得最佳的 ChIP 结果,每次免疫沉淀使用 10 μl 抗体和 10 μg 染色质(大约 4 x 106 个细胞)。该抗体已使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kits 进行了验证。
使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 测定 CUT&RUN 使用稀释比。
应用 | 稀释度 |
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蛋白质印迹法 | 1:1000 |
免疫沉淀 | 1:50 |
染色质免疫沉淀法 | 1:50 |
CUT&RUN | 1:50 |
保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。
蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。
注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。
从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit
注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。
注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。
* 避免反复接触皮肤。
发布于 2005 年 6 月
修订于 2020 年 6 月
实验步骤编号:19
本实验步骤适用于使用蛋白 G 磁性分离法对天然蛋白进行免疫沉淀,以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。
注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。
注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。
强烈建议进行细胞裂解物预清除步骤,以减少结合 Protein G Magnetic beads 的非特异性蛋白。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。
重要提示:使用前,预先洗涤 #70024 磁珠:
转移 20 μl 珠浆到一根干净的试管中。将试管放在磁分离架上 10-15 秒钟。
一旦溶液变澄清,便小心清除缓冲液。添加 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液到磁珠沉淀物中,稍微涡旋以洗涤珠子。将试管放回磁分离架。一旦溶液变澄清,便清除缓冲液。再次进行洗涤步骤。
重要提示:最佳裂解物浓度将取决于目的蛋白的表达水平。建议起始浓度为 250 μg/ml-1.0 mg/ml。
重要提示:强烈建议使用相应的同型对照,以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。使用 Normal Rabbit IgG #2729、Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 和 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 分别进行兔多克隆一抗、兔单克隆一抗和小鼠单克隆一抗的对照检测。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。
继续下述其中一项的具体步骤。
注意:对于分子量大约为 50 kDa 的蛋白,我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP 缀合物 #5127)作为二抗,以尽量减少变性重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白,建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP 缀合物 #5127),以尽量减少变性轻链产生的干扰。
发布于 2008 年 12 月
修订于 2018 年 4 月
实验步骤编号:121
特定产品: SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005。
包括的试剂:
未包括的试剂:
! | 这就表示在实验流程中基于免疫沉淀制备物(IP 制备物)数量的容积改变是重要的一步。一份 IP 制备物是指 4 x 106 个组织培养细胞或 25 mg 离体的组织。 |
!! | 这就表示,进行操作前稀释缓冲液是重要的一步。 |
安全停止 | 如果需要停止,这是实验步骤中的一个安全停止点。 |
当收获组织时,去除样品上不需要的材料,如脂肪和坏死组织。随后可以立即处理并交联组织,或在干冰上冷冻并储存于 -80°C 以待稍后处理。为获得最佳的染色质产率和 ChIP 结果,每次进行免疫沉淀法测试时,使用 25 mg 的组织。不同组织类型的染色质产率也不尽相同,并且一些组织在每次免疫沉淀法测试需要超过 25 mg。有关不同组织类型的预期染色质产率的更多信息,请参见附录 A。额外需要一份染色质样品进行染色质消化和浓度分析(第四部分)。如果需要,应处理额外五份染色质样品,以最优化染色质消化(附录 B)。
(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中 IP 制备物的数量成比例的增加。
为达到最佳染色质免疫沉淀法结果,每次免疫沉淀法使用大约 4 X 106 细胞进行实验(至少需要 12 X 106 个细胞以包含阳性和阴性对照)。对于 Hela 细胞,一次免疫沉淀相当于 15 cm 培养皿所含细胞(在 20 ml 生长培养基中的融合度为 90%)的一半。要进行染色质消化和浓度分析,应当处理一份额外样品(第四部分)。因为每种细胞类型都不相同,我们推荐您在实验中准备一盘额外的细胞,通过使用血球仪或细胞计数器确定细胞的数量。
(!) 所有缓冲液体积应根据使用的 15 cm 组织培养皿(或 20 ml 悬浮细胞)数量按比例增加。
(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中 IP 制备物的数量成比例的增加。
(!!) 重要提示:一旦溶解,将 1 M DTT 置于 -20℃ 下存放。
注意:为了获得最佳的 ChIP 结果,适宜大小和合适浓度的染色质非常关键。染色质过度消化可能会在 PCR 定量时削弱信号。染色质消化不充分可能导致背景信号增加和分辨率降低。向 IP 中添加染色质过少可能导致在 PCR 定量时信号削弱。优化染色质消化的实验步骤可以在附录 B 中找到。
为了获得最佳的 ChIP 结果,每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 μg 消化的交联染色质(如第四部分中所测定)。这应当和来自 25 mg 分散的组织或 4 x 106 个组织培养细胞的单一 100μl IP 制备物大致相等。在添加抗体之前,通常将 100μl 消化的染色质稀释到 400μl 1X ChIP 缓冲液中。但是,如果每次 IP 需要 100 μl 以上的染色质,则交联的染色质制备物不需要按照下述方法进行稀释。可以直接向未稀释的染色质制备物中添加抗体以对染色质复合体进行免疫沉淀测试。
(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。
注意:Cell Signaling Technology 抗体在每份处于 1 和 2 ug 之间 IP 样品会取得最佳效果。当存在多份不同浓度的样品时,最好使阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。
(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。
引物长度: | 24 个核苷酸 |
最佳 Tm: | 60℃ |
最佳 GC: | 50% |
扩增子尺寸: | 150 至 200 bp(标准 PCR) |
80 至 160 bp(实时荧光定量 PCR) |
试剂 | 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl) |
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无核酸酶的 H2O | 12.5 μl |
10X PCR 缓冲液 | 2.0 μl |
4mM dNTP 混合物 | 1.0 μl |
5 μM RPL30 引物 | 2.0 μl |
Taq DNA 聚合酶 | 0.5 μl |
a. | 初始变性 | 95℃ | 5 分钟 |
b. | 变性 | 95℃ | 30 秒 |
c. | 复性 | 62℃ | 30 秒 |
d. | 延伸 | 72℃ | 30 秒 |
e. | 重复步骤 b-d,共循环 34 次。 | ||
f. | 终末延伸 | 72℃ | 5 分钟 |
试剂 | 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl) |
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无核酸酶的 H2O | 6 μl |
5 μM RPL30 引物 | 2 μl |
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 | 10 μl |
a. | 初始变性 | 95℃ 3 分钟 |
b. | 变性 | 95℃ 15 秒 |
c. | 复性和延伸: | 60℃ 60 秒 |
d. | 重复步骤 b 和 c,共循环 40 次。 |
使用实时 PCR 仪的自带软件,分析定量 PCR 结果。或者,可以使用input样品百分数方法和以下所示的公式,手动计算 IP 效率。采用这种方法,从每次免疫沉淀获得的信号表述为占总input样品染色质的百分比。
输入百分比 = 2% x 2(C[T] 2% 输入样品 – C[T] IP 样品)
C[T] = CT = PCR 反应的阈周期
用这种试剂盒制备的免疫富集的 DNA 样品可用于 ChIP-seq 。要构建下游 NG 测序用 DNA 文库,请使用与您的下游测序平台相容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。如要在 Illumina® 平台上进行测序,我们建议使用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 及其相关索引引物 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580 或 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538。
建议:
从组织样品收获交联的染色质时,组织类型之间的染色质产率可能显著不同。右表显示了用 25 mg 组织(类似于 4 x 106 个 Hela 细胞)制备的染色质预期产率和预期 DNA 浓度的范围,该产率和浓度按实验步骤第四部分的方法测定。对于每种组织类型,使用 Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器离散获得了相似数量的染色质。但是,与用通过 Dounce 匀浆器离散的组织制备和处理的染色质相比,用通过 Medimachine 离散的组织制备和处理的染色质通常具有更高的 IP 效率。强烈推荐 Dounce 匀浆器用于离散脑组织,原因是 Medimachine 无法将脑组织充分分离成单细胞悬液。为了获得最佳的 ChIP 结果,我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 μg 消化的交联染色质,因此,对于某些组织,每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。
组织/细胞 | 染色质总产率 | 预期 DNA 浓度 |
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脾 | 20-30 μg/25 mg 组织 | 200-300 μg/ml |
肝 | 10-15 μg/25 mg 组织 | 100-150 μg/ml |
肾 | 8-10 μg/25 mg 组织 | 80-100 μg/ml |
脑 | 2-5 μg/25 mg 组织 | 20-50 μg/ml |
心脏 | 2-5 μg/25 mg 组织 | 20-50 μg/ml |
Hela | 10-15 μg/4 x 106 个细胞 | 100-150 μg/ml |
将交联的染色质 DNA 消化成 150-900 个碱基对长度的最佳条件高度取决于 Micrococcal Nuclease 对消化中所用组织量或细胞数目的比率。以下是确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的实验步骤。
问题 | 可能的原因 | 建议 |
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1. 消化的染色质浓度过低。 | 添加至染色质消化的细胞数不足,或者胞核在消化后未完全裂解。 | 如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml,则向每次 IP 中添加额外的染色质以确保每次 IP 至少产生 5 μg,然后继续实验。 在交联之前计算备用平板上细胞的数量,以确定准确的细胞数量,和/或在声波处理前后在显微镜下观察胞核,以证实胞核完全裂解。 |
2. 染色质消化不足且片段过大(大于 900 bp)。 | 细胞可能已经过度交联。交联超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。 向染色质消化中添加过多细胞或未添加足够的 Micrococcal Nuclease。 | 在甲醛浓度固定的情况下进行一段时间。将交联时间缩短至 10 分钟或更短。 在交联之前计算备用平板上细胞的数量,以确定准确的细胞数量;有关染色质消化的优化,参见附录 B。 |
3. 染色质过度消化并且片段过小(只有 150 bp 单核小体的长度)。在 PCR 定量期间,将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能削弱信号,尤其对于长度大于 150 bp 的扩增子更是如此。 | 添加至染色质消化的细胞不足或 Micrococcal Nuclease 过多。 | 在交联之前计算备用平板上细胞的数量,以确定准确的细胞数量;有关染色质消化的优化,参见附录 B。 |
4. 样品输入对照组 PCR 反应中无产物或产物很少。 | 添加至 PCR 反应的 DNA 不足或条件不是最佳。 PCR 扩增区域可能跨越无核小体的区域。 添加至 IP 反应的染色质不足或染色质过度消化。 | 向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。 使用来自交联并消化后的染色质的纯化 DNA,优化实验引物组的 PCR 条件。设计不同的引物组并将扩增子的长度减少到小于 150 碱基对(请参见第八部分中的引物设计建议)。 为获得最佳 ChIP 结果,每次 IP 添加 5-10 μg 染色质。参见上述问题 1 和 3 的建议。 |
5. 阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中无产物。 | 添加至 IP 反应的染色质或抗体不足,或者 IP 孵育时间过短。 蛋白 G 微珠中染色质洗脱不完全。 | 确保向每次 IP 反应中添加 5-10 μg 染色质和 10 μl 抗体并和抗体一起孵育过夜。在添加蛋白 G 微珠后需额外孵育 2 小时。 在 65℃ 下将染色质从蛋白 G 微珠洗脱为最佳,同时频繁混合以保持微珠悬浮在溶液中。 |
6. 阴性对照 Rabbit IgG-IP 和阳性对照 Histone H3-IP PCR 反应中产物的数量相等。 | 添加至 IP 反应的染色质过多或不足。或者,添加至 IP 反应的抗体过多。 添加至 PCR 反应的 DNA 过多或扩增循环次数过多。 | 向每次 IP 反应中添加不超过 15 μg 的染色质和 10 μl Histone H3 Antibody。每次 IP 将 Normal Rabbit IgG 缩减至1 µl/IP。 向 PCR 反应中添加更少的 DNA 或减少 PCR 循环次数。在 PCR 的线性扩增阶段范围内分析 PCR 产物极为重要。否则,不能准确测量起始 DNA 数量的差异。 |
7. 实验抗体 IP PCR 反应中无产物。 | 添加至 PCR 反应的 DNA 不足。 添加至 IP 反应的抗体不足。 抗体不适用于 IP。 | 向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。 通常,需向 IP 反应中添加 1 至 5 µg 的抗体;但是,实际加入量很大程度上取决于各个抗体本身。 增加添加至 IP 反应的抗体量。寻找其他替代抗体。 |
发布于 2011 年 12 月
修订于 2018 年 6 月
实验步骤编号:82
! | ! 表示实验步骤中需要根据进行的 CUT & RUN 反应次数来调整体积的重要步骤。 |
!! | !! 表示需要在操作前稀释缓冲液的一个重要步骤。 |
安全停止 | 如果需要停止,这是实验步骤中的一个安全停止点。 |
注意: 细胞制备步骤(步骤 6-16) 应在室温下连续进行,以最大程度减少细胞应激。为了最大限度减少 DNA 碎裂,在重悬过程中应避免剧烈涡旋和气泡产生。
注意:在本实验步骤中,每次反应使用 100,000 个细胞。但这些相同的反应条件也可适用于每份样品用 10,000 至 250,000 个细胞。
注意: 建议用于细胞通透的洋地黄皂苷的量为过量,应足以满足大多数细胞系的通透。但并非所有细胞系对洋地黄皂苷都显示出相同的敏感性。在您开始实验之前,建议您按照附录 A 中提供的实验步骤来测试您的特定细胞系。洋地黄皂苷处理应使 >90% 的细胞完成通透处理。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注意:洋地黄皂苷溶液应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
注意:避免将伴刀豆球蛋白 A 磁珠悬浮液涡旋,因为反复涡旋可能会使伴刀豆球蛋白 A 从珠子中移位。
注意:为了避免珠子丢失,请使用移液枪来移除液体。请勿使用真空设备抽吸。
注意:在随后的实验步骤中,将在 55°C 下孵育input样品,因此建议使用一根可封盖的 1.5 ml 试管,以减少孵育过程出现蒸发。
注意:Concanavalin A 磁珠可能会结块或粘附在试管壁上。上下吹打来重悬珠子。
注意:CUT&RUN 需要的抗体量不定,应由使用者确定。对于阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb,向样品中添加 2 µl 抗体。对于阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362,向样品中添加 5 µl。我们强烈建议使用阴性对照抗体,而不是非抗体对照,因为后者会导致高水平的非特异性 MNase 消化和高背景信号。我们建议使用input样品作为 qPCR 和 NG-seq 分析的对照样品。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注意:洋地黄皂苷溶液应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注意:洋地黄皂苷溶液应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
注意:应在 4°C 的冷却模块或冰箱中进行消化。冰的温度可低至 0°C,这可能会限制消化并降低信号。
注意:该孵育步骤可以延长到 30 分钟。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在制备的input样品的数量按比例增加。
注意:可能需要按照附录 B 中的实验步骤测试不同的超声波仪功率设置和/或超声处理持续时间,以根据经验确定超声处理条件。最佳超声处理条件将产生大小为 100-600 bp 的染色质片段。使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探针的 VirTis Virsonic 100 超声波均质器/超声波仪以 5 组 15 秒脉冲进行超声处理,可充分碎裂input染色质。
如 A 部分所述,使用 DNA 离心柱可从input和富集染色质样品中纯化 DNA,或如第 B 部分所述,使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法进行纯化。使用 DNA 离心柱纯化简单快速,可很好地回收 35 bp 以上的 DNA 片段(图 7A,泳道 2)。苯酚/氯仿提取之后再行乙醇沉淀更加困难,但能很好地回收 35 bp 以下的 DNA 片段(图 7A,泳道 3);但如图 7B 所示,大多数在 CUT&RUN 检测中产生的 DNA 片段大于 35 bp。因此,DNA 离心柱提供一种快速简单的方法来纯化 > 98% 的所有 CUT&RUN DNA 片段。
在 NG-seq 分析之前,使用基于 picogreen 的 DNA 定量测定法可以对纯化的 DNA 进行定量。对于含 100,000 个细胞的 CUT&RUN 反应,一次转录因子和辅因子的 CUT&RUN 反应中,预期 DNA 产量为 0.5-10 ng,而在一次组蛋白修饰反应中则为 1-20 ng。
图 7. 比较使用离心柱或苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法进行的 DNA 纯化。(A) 低量程 DNA 分子量标准(泳道 1,未纯化)使用 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209(泳道 2)进行纯化,或使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法(泳道 3)进行纯化,并在 4% 琼脂糖凝胶电泳来进行分离。如图所示,苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀能有效回收所有大小的 DNA 片段,而 DNA 离心柱仅能回收 ≥ 35 bp 的 DNA 片段。(B) 在使用 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 的 CUT&RUN 检测中使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化 DNA。使用一台Bioanalyzer (Agilent Technologies) 分析文库中 DNA 片段的大小。在构建期间添加到文库中的接头蛋白和条码序列的片段长度为 140 bp。因此,文库制备后,起始 35 bp 的 DNA 片段长度将变为 175 bp(图中用蓝色垂直线标注)。如图所示,总 CUT&RUN 富集 DNA 片段中不到 2% 短于 175 bp(起始长度 35 bp),提示 DNA 纯化离心柱足以捕获 > 98% 的总 CUT&RUN DNA 片段。
注意:使用 Cell Signaling® DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209(未包含在本试剂盒中)以及下面修改后的实验步骤从input样品和富集染色质样品中纯化 DNA。步骤 1-5 已修改,以符合向 300 µl input样品和富集染色质样品中添加 5 倍体积 (1.5 ml) DNA 结合缓冲液的要求。
注意:1 体积样品应使用 5 体积的 DNA 结合缓冲液。
注意:以下试剂是苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀所必需的,不包含在本试剂盒中:苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)、氯仿/异戊醇 (24:1)、3M 乙酸钠 (pH 5.2)、20 mg/ml 糖原、100% 乙醇、70% 乙醇和 1X TE 缓冲液或无核酸酶水。
注意:如果进行样品标准化,仅CUT&RUN 样品使用Sample Normalization Primer Set分析 。input DNA 不包含Normalization Spike-In DNA。
试剂 | 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl) |
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Nuclease-free H2O #12931 | 6 μl |
5 µM 引物 | 2 μl |
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 | 10 μl |
a. | 初始变性 | 95°C,3 分钟 |
b. | 变性 | 95°C,15 秒钟 |
c. | 退火和延伸 | 60°C,60 秒钟 |
d. | 重复步骤 b 和 c,共循环 40 次。 |
样品标准化引物组的 C[T] 值 | **qPCR 的标准化系数 | 标准化之前的信号(步骤 5 中计算出的输入百分比) | 标准化之后的信号 | |
样品 1 | 23.31 | 2(23.31-23.31)=1.00 | 24.4% | 24.4%/1.00=24.4% |
样品 2 | 24.24 | 2(23.31-24.24)=0.52 | 12.0% | 12.0%/0.52=23.1% |
样品 3 | 25.08 | 2(23.31-25.08)=0.29 | 6.28% | 6.28%/0.29=21.7% |
样品 4 | 26.30 | 2(23.31-26.30)=0.13 | 2.72% | 2.72%/0.13=20.9% |
**qPCR 的标准化系数 = 2(C[T] 选定样品 – C[T] 其他样品)
图 8. 应用添加的Spike-In DNA对 CUT&RUN 信号进行 qPCR 标准化分析。对数量渐减的 HCT116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751(上小图)或 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499(下小图)进行 CUT&RUN。使用 SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516、SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653、SimpleChIP® Human Β-Actin 3' UTR Primers #13669 和 SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品中免疫沉淀 DNA 的数量表示为与 100,000 个细胞的input染色质总量相对应的信号。左图中为非标准化的富集结果。在每次反应中,按照与起始细胞数量成比例的方式添加 Sample Normalization Spike-In DNA。根据每份样品中添加 DNA 所产生的 qPCR 信号差异,将 CUT&RUN 信号标准化为含 100,000 个细胞的样品。右图显示了标准化后的富集。
用这种试剂盒制备的免疫富集 DNA 样品直接兼容 NG-seq。要构建下游 NG-seq DNA 文库,请使用与您的下游测序平台兼容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。对于在 Illumina® 平台上测序,我们建议使用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 和 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® #29580 或 #47538。
与酵母对应的unique reads数 | NGS 的标准化系数 | 标准化之前与测试参考基因组对应的unique reads数 | NGS 的标准化系数 = 选定样品的酵母 reads数/其他样品的酵母unique reads数 | |
样品 1 | 219,275 | 219,275/219,275 = 1.00 | 5,077,747 | 5,077,747 X 1.00 = 5,077,747 |
样品 2 | 411,915 | 219,275/411,915 = 0.53 | 9,896,671 | 9,896,671 X 0.53 = 5,268,306 |
样品 3 | 816,235 | 219,275/816,235 = 0.27 | 17,842,773 | 17,842,773 X 0.27 = 4,793,320 |
样品 4 | 1,120,826 | 219,275/1,120,826 = 0.20 | 23,836,679 | 23,836,679 X 0.20 = 4,663,339 |
NGS 的标准化系数 = 选定样品的酵母unique reads数/其他样品的酵母unique reads数
在 CUT&RUN 实验步骤中,向缓冲液中添加洋地黄皂苷能促进细胞膜透化以及一抗和 pAG-MNase 酶进入细胞和胞核。因此,缓冲液中有足量的洋地黄皂苷对抗体和酶的成功结合以及靶向基因位点的消化至关重要。不同细胞系对洋地黄皂苷细胞透化有不同的敏感性。虽然本实验步骤中建议的洋地黄皂苷量应足以对大多数细胞系进行透化,但我们仍然建议对你的特定细胞系进行初步测试。我们发现,添加过量的洋地黄皂苷对本实验没有损害,因此无需生成浓度曲线。所以,进行快速测试以确定建议的洋地黄皂苷量是否适合你的细胞系就足够了。
注意:洋地黄皂苷溶液应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
建议对input DNA 样品进行超声处理,因为 DNA 纯化离心柱只能纯化片段化的基因组 DNA (< 10 kb)。此外,片段化的基因组 DNA (< 1 kb) 可在 NG-seq 分析中用作阴性对照。应优化超声处理,以便input DNA 的长度为 100-600 bp。
我们建议使用input样品进行 NG-seq,因为它能方便且无偏倚的呈现细胞基因组。虽然 IgG 样品也可在 NG-seq 中用作阴性对照,但由于存在非特异性结合,它可能会显示基因组特定区域出现富集。非片段化input DNA 可用于 qPCR 分析。但必须使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化非片段化的 DNA。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在制备的input样品的数量按比例增加。
主要:在步骤 9 中,在 55°C 下孵育样品,因此建议使用一个可锁密封盖的 1.5 ml 管子,以减少孵育过程中出现蒸发。
问题 | 可能的原因 | 建议 |
---|---|---|
1. 在实验期间,Concanavalin A 珠子会结块。 | 珠子结块是正常的,并且通常不会影响检测。 | 轻轻上下吹打来重悬结块的珠子。 |
室温孵育珠子和细胞的时间过长。 | 在 4°C 下激活 Concanavalin A 珠子,并且细胞孵育不超过 5 分钟(第 I 部分步骤 14)。 | |
细胞在制备期间裂解。 | 确保在室温下尽快制备细胞,以最大程度地减少细胞应激(第 I 部分步骤 7-16)。 | |
洋地黄皂苷浓度可能太高。 | 一些细胞可能对洋地黄皂苷更敏感,且在更高浓度下裂解。减少检测中的洋地黄皂苷量,但要确认使用的量足以进行细胞透化(见附录 A)。 | |
2. 使用基于 picogreen 的 DNA 定量测定法时,在纯化的 DNA 样品中未检测到 DNA。 | 这通常发生在使用起始数量较少的细胞时(< 10,000 个细胞)起始时,但当使用建议的 100,000 个起始细胞时应能检测到 DNA。 | 确保使用基于picogreen 的 DNA 定量测定法。使用 NanoDrop、Bioanalyzer® 或 Tapestation® 通常无法检测到纯化的 DNA。 |
在制备期间,可能会发生细胞计数下降,细胞丢失或裂解。 | 起始细胞培养应为 60-90% 融合度且看起来健康 (> 90% 活细胞)。 | |
确保在室温下尽快制备细胞,以最大程度地减少细胞应激。 | ||
清洗试管中的所有细胞,以最大程度地减少细胞丢失(第 I 部分步骤 7-16)。 | ||
洋地黄皂苷不能有效使细胞通透。 | 不使用时,确保将洋地黄皂苷溶液保存在 -20°C 下,因为保存在 -20°C 以上时,它不稳定。 | |
确保测试并确认使用的洋地黄皂苷量足以通透您的特定细胞系(见附录 A)。 | ||
pAG-MNase 酶在检测中无法正常工作。 | pAG-MNase 的稳定性很高,并且在妥善保存时应能保持长时间的活性。 | |
pAG-MNase 需要 Ca2+ 二价阳离子才能激活。确保添加氯化钙来激活酶(第 III 部分步骤 8)。 | ||
确保消化 30 分钟,以使酶能充分消化染色质(第 III 部分步骤 9)。 | ||
在反应中未加入足量的抗体,或抗体在 CUT&RUN 实验中不工作。 | 并非所有抗体都可应用于 CUT&RUN 。如可能,使用一种经 CUT&RUN 验证的抗体。或者,一些经 ChIP 和 IF 验证的抗体对 CUT&RUN 也有效。 | |
确保包含阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb,以证实您的检测是有效的。 | ||
3. qPCR 或 NG-seq 分析中没有信号。 | 查看问题 2 的可能原因。 | 查看问题 2 的建议。 |
qPCR 反应中未添加足量的 DNA。 | 向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。 | |
NG-seq DNA 库制备中未添加足量的 DNA。 | 确保使用一种基于 picogreen 的 DNA 定量测定法来定量纯化的 DNA,并使用建议的起始 DNA 量和 PCR 扩增周期(见第 VII 部分)。 | |
PCR 扩增区域可能横跨无核小体的区域。 | CUT&RUN 检测中生成的 DNA 片段通常比 ChIP 实验中生成的 DNA 片段小。因此,设计引物来生成不长于 60-80 bp 的扩增子至关重要。 | |
4. qPCR 或 NG-seq 分析中的背景信号高。 | 样品处理过度,基因组 DNA 已经被高度碎裂。 | 始终使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 阴性对照抗体来确定 CUT&RUN 检测中的背景信号。 |
为最大限度地减少 DNA 碎裂,避免在细胞再悬浮期间剧烈涡旋和产生气泡。 | ||
由于细胞应激和裂解,基因组 DNA 已被高度碎裂。 | 确保在室温下尽快制备细胞,以最大程度地减少细胞应激。清洗试管中的所有细胞,以最大程度地减少细胞丢失(第 I 部分步骤 7-16)。 | |
在 0°C 下未进行消化,且染色质过度消化。 | 应在冰水浴中进行消化。在较高温度下消化会显著增强背景信号。 | |
在添加氯化钙和开始消化之前,请先确保将细胞样品和氯化钙放在冰水浴中预冷 5 分钟。快速混合样品并放回冰水浴中。 | ||
非特异性基因组 DNA 大片段还会扩散到上清液中,并且污染由靶向酶解剪切产生的较小片段。 | 请勿在 37°C 下孵育样品超过 10 分钟,也不要在孵育期间摇晃样品(第 III 部分步骤 11)。十分钟足以使被消化的片段扩散到上清液中。 | |
在 qPCR 分析前,使用 AMPure® XP Beads 或 SPRIselect® Reagent Kit 选择大小可以去除基因组 DNA 大片段。 | ||
对于 NG-seq 分析,在文库构建期间缩短 PCR 扩增时间(10-15 秒钟),即可排除 DNA 大片段扩增。 | ||
检测中使用过多抗体,导致非特异性结合和消化。 | 如可能,确保按推荐的稀释度使用一种经 CUT&RUN 验证的抗体。如果没有,经 ChIP 验证和经 IF 验证的抗体在建议的 ChIP 和 IF 稀释度下通常有效。您可能需要在检测中通过滴定实验确定抗体用量。 |
发布于 2019 年 10 月
修订于 2021 年 1 月
实验步骤编号:1884
Rpb1 CTD (4H8) Antibody 可检测内源水平的 Rpb1 总蛋白(磷酸化和未磷酸化两种形式)。
人, 小鼠, 大鼠, 猴
仓鼠 , 黑腹果蝇 , 酿酒酵母
使用包含 Ser5 位点被磷酸化的 10 个七肽重复序列(Tyr1、Ser2、Pro3、Thr4、Ser5、Pro6 和Ser7)的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。
RNA 聚合酶 II (RNAPII) 是一个大型多蛋白复合体,可作为 DNA 依赖的 RNA 聚合酶,能够以四种核糖核苷三磷酸盐作为底物来催化 DNA 转录为 RNA (1)。最大亚基 RNAPII 亚基 B1 (Rpb1) 又称 RNAPII 亚基 A (POLR2A),包含一个唯一的七肽序列 (Tyr1, Ser2, Pro3, Thr4, Ser5, Pro6, Ser7),在蛋白的羧基末端结构域 (CTD) 中可重复多达 52 次 (1)。这个 CTD 七肽重复序列会发生多次翻译后修饰,这可决定聚合酶复合体的功能状态。在活跃转录周期中,CTD 磷酸化可通过调节染色质修饰酶和 RNA 加工蛋白募集到转录基因的过程,从而整合染色质重构和新生 RNA 加工转录 (1)。在转录起始过程中,RNAPII 有一个低磷酸化 CTD,并通过与 DNA 结合转录因子以及调节物复合体相互作用而被募集到基因启动子 (1)。RNAPII 从基因启动子上脱离需要 CDK7 磷酸化 Ser5,CDK7 是转录因子 IIH (TFIIH) 的催化亚基 (2)。除了组蛋白 H3 Lys4 甲基转移酶,Ser5 磷酸化还会介导 RNA 加帽酶的募集,从而调节转录起始和染色质结构 (3,4)。从启动子上脱离后,RNAPII 继续将基因下移到固有终止位点,从而被负向延伸因子 NELF 和 DSIF 阻滞 (5)。此时,RNAPII 不稳定并且会频繁中止转录并与基因分离。有效的转录延伸需要 CDK9 磷酸化Ser2位点,CDK9 是正向转录延伸因子 P-TEFb 的催化亚基 (6)。Ser2 磷酸化会产生一种稳定的转录延伸复合体,并促进 RNA 剪切和多聚腺苷酸化因子的募集,另外还包括可促进延伸因子相容性染色质的组蛋白 H3 Lys36 甲基转移酶的募集 (7,8)。Ser2/Ser5 磷酸化的 RNAPII 随后将全长基因转录到终止转录的 3' 端。RNAPII 从 DNA 上分离,并通过各种 CTD 磷酸酶再循环为去磷酸化形式 (1)。
除 Ser2/Ser5 磷酸化外,CTD 七肽重复序列的 Ser7 在活跃转录周期中也被磷酸化。Ser7 磷酸化是小核 (sn) RNA 基因的有效转录所必需的 (9,10)。未剪切或未被多聚腺苷酸化的 snRNA 基因在结构上与蛋白编码基因不同。与蛋白编码 RNA 中的多聚腺苷酸信号不同的是,snRNA 有一个保守的 3' 盒 RNA 加工元件,该元件能够被整合因子 snRNA 3' 端加工复合体识别 (11,12)。在转录的早期阶段,CDK7 磷酸化 Ser7 可促进 RPAP2 的募集,RPAP2 会去磷酸化 Ser5,产生可促进整合因子复合体的募集及新生 snRNA 转录物有效加工的双 Ser2/Ser7 磷酸化标记 (13-15)。
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