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83732
Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体

Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) Rabbit mAb #83732

引用 (3)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1: Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) Rabbit mAb

使用 Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) Rabbit mAb(上图)或 GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb #(下图)对用以下组合处理方法处理 (+) 的 Colo 205 细胞进行蛋白质印迹分析,如下:用过氧化氢(500 μM,5 分钟)处理,或经过氧化氢处理的裂解物再用磷酸二酯酶 1(0.5 μg/mL,4 小时,在 37ºC 下)或 tcPARG(5 μM,4 小时,在 37ºC 下)处理5174。

Western Blotting Image 2: Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) Rabbit mAb

使用 Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) Rabbit mAb(上图)或 β-Tubulin (9F3) Rabbit mAb #2128(下图)对未经 (-) 或已经过氧化氢(500μM,5 分钟;+)处理的 Colo 205 细胞进行蛋白质印迹分析。

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支持数据

反应性 所有物种
敏感性 内源性
MW (kDa)
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

特异性/敏感性

Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) RmAb 可检测 ADP 核糖基化蛋白的内源水平,但不会与其他翻译后修饰发生交叉反应。

物种反应性:

预期的所有物种

来源/纯化

使用赖氨酸被 ADP 核糖修饰的 KLH 对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

ADP 核糖基化是一种翻译后修饰,这种修饰被发现会发生在多种受体残基(赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、丝氨酸)的侧链和蛋白氨基末端以及 DNA 和 tRNA 上 (1)。ADP 核糖基化转移酶 (ADPRT) 会催化 ADP 核糖从 β-NAD+ 上发生转移,并在此过程中释放烟酰胺。单 ADP 核糖基化转移酶(MART 或单 PARP)包含大多数 ADPRT。这些单酶(包括去乙酰化酶和许多 PARP (ARTD) 和 ART 蛋白)可将单个 ADP 核糖单元转移到靶标残基(MAR 化)。聚 ADP 核糖聚合酶(聚 PARP)或多酶包括人 PARP1、2、5a 和 5b,它们是备受广泛研究的酶,并能聚合多达 200 个 ADPR 单元的线性链或支链 (2)。特异性主要(但不是只能)通过非连续性催化三联基序进行确定,其中有一些例外情况。这些含 R-S-E 基序的酶(如霍乱毒素)是精氨酸定向转移酶,而含 H-Y-E 三联基序的酶则显示出聚合酶活性 (3,4)。ADP 核糖基化是可逆的,聚 ADP 核糖甘油水解酶 (PARG) 或 ADP 核糖水解酶 3 (ARH3) 会将其分解为单个 ADP 核糖单元,或者 ARH1、TARG1、MacroD1 或 MacroD2 会将其从靶标残基上彻底去除 (5)。

ADP 核糖基化参与各种细胞进程,包括有丝分裂纺锤体形成、染色质解凝、细胞应激反应、逆转录病毒沉默、RNA 生物生成以及转录,但 ADP 核糖链的多数已知功能是还可作为将含 PAR 结合分子的 DNA 修复蛋白募集到 DNA 损伤位点的支架 (6)。X 射线修复交叉互补蛋白 1 (XRCC1)、组蛋白 macroH2A1、RNF146 (Iduna) (一种 E3 泛素连接酶),其中,许多 PARP 本身含有 PAR 结合基序 (PBM) 或结构域:WWE、PAR 结合锌指 (PBZ) 或大结构域 (7)。PAR 化在细胞存活中发挥核心作用,并受严格调控。PARP 缺损会让细胞容易出现 DNA 损伤诱导的凋亡,而高度 PAR 化则会导致一种特殊的细胞死亡(依赖性细胞死亡)(8)。PAR 化在 DNA 修复中的作用引发人们对开发 PARP 候选药物抑制剂产生了极大兴趣,尤其是用于治疗 BRCA1/2、CHK2 或 ATM 等 DNA 修复基因出现突变的乳腺癌、前列腺癌和小细胞肺癌的抑制剂。Stat1、PERK、p53、G-肌动蛋白和 Ras 只是在功能上受 ADP 核糖基化调控的蛋白的几个例子 (6,7)。ADP 核糖修饰会阻碍蛋白相互作用,或(如果是 P2X7)会导致构象变化,在有 ART2 表达的情况下,这种构象变化会使原初小鼠 T 细胞对胞外 NAD+ 敏感,从而导致凋亡 (9)。

  1. Koch-Nolte, F. et al. (2008) Front Biosci 13, 6716-29.
  2. Leung, A.K. (2014) J Cell Biol 205, 613-9.
  3. Laing, S. et al. (2011) Amino Acids 41, 257-69.
  4. Vyas, S. et al. (2014) Nat Commun 5, 4426.
  5. Vivelo, C.A. and Leung, A.K. (2015) Proteomics 15, 203-17.
  6. Gupte, R. et al. (2017) Genes Dev 31, 101-126.
  7. Wei, H. and Yu, X. (2016) Genomics Proteomics Bioinformatics 14, 131-139.
  8. David, K.K. et al. (2009) Front Biosci (Landmark Ed) 14, 1116-28.
  9. Seman, M. et al. (2003) Immunity 19, 571-82.

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