反应性 | 所有物种 |
敏感性 | 内源性 |
MW (kDa) | |
来源/亚型 | 兔 IgG |
产品信息
应用 | 稀释度 |
---|---|
蛋白质印迹法 | 1:1000 |
保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。
要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。
注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。
从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit
注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。
注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。
* 避免反复接触皮肤。
发布于 2005 年 6 月
修订于 2020 年 6 月
实验步骤编号:10
Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) RmAb 可检测 ADP 核糖基化蛋白的内源水平,但不会与其他翻译后修饰发生交叉反应。
预期的所有物种
使用赖氨酸被 ADP 核糖修饰的 KLH 对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。
ADP 核糖基化是一种翻译后修饰,这种修饰被发现会发生在多种受体残基(赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、丝氨酸)的侧链和蛋白氨基末端以及 DNA 和 tRNA 上 (1)。ADP 核糖基化转移酶 (ADPRT) 会催化 ADP 核糖从 β-NAD+ 上发生转移,并在此过程中释放烟酰胺。单 ADP 核糖基化转移酶(MART 或单 PARP)包含大多数 ADPRT。这些单酶(包括去乙酰化酶和许多 PARP (ARTD) 和 ART 蛋白)可将单个 ADP 核糖单元转移到靶标残基(MAR 化)。聚 ADP 核糖聚合酶(聚 PARP)或多酶包括人 PARP1、2、5a 和 5b,它们是备受广泛研究的酶,并能聚合多达 200 个 ADPR 单元的线性链或支链 (2)。特异性主要(但不是只能)通过非连续性催化三联基序进行确定,其中有一些例外情况。这些含 R-S-E 基序的酶(如霍乱毒素)是精氨酸定向转移酶,而含 H-Y-E 三联基序的酶则显示出聚合酶活性 (3,4)。ADP 核糖基化是可逆的,聚 ADP 核糖甘油水解酶 (PARG) 或 ADP 核糖水解酶 3 (ARH3) 会将其分解为单个 ADP 核糖单元,或者 ARH1、TARG1、MacroD1 或 MacroD2 会将其从靶标残基上彻底去除 (5)。
ADP 核糖基化参与各种细胞进程,包括有丝分裂纺锤体形成、染色质解凝、细胞应激反应、逆转录病毒沉默、RNA 生物生成以及转录,但 ADP 核糖链的多数已知功能是还可作为将含 PAR 结合分子的 DNA 修复蛋白募集到 DNA 损伤位点的支架 (6)。X 射线修复交叉互补蛋白 1 (XRCC1)、组蛋白 macroH2A1、RNF146 (Iduna) (一种 E3 泛素连接酶),其中,许多 PARP 本身含有 PAR 结合基序 (PBM) 或结构域:WWE、PAR 结合锌指 (PBZ) 或大结构域 (7)。PAR 化在细胞存活中发挥核心作用,并受严格调控。PARP 缺损会让细胞容易出现 DNA 损伤诱导的凋亡,而高度 PAR 化则会导致一种特殊的细胞死亡(依赖性细胞死亡)(8)。PAR 化在 DNA 修复中的作用引发人们对开发 PARP 候选药物抑制剂产生了极大兴趣,尤其是用于治疗 BRCA1/2、CHK2 或 ATM 等 DNA 修复基因出现突变的乳腺癌、前列腺癌和小细胞肺癌的抑制剂。Stat1、PERK、p53、G-肌动蛋白和 Ras 只是在功能上受 ADP 核糖基化调控的蛋白的几个例子 (6,7)。ADP 核糖修饰会阻碍蛋白相互作用,或(如果是 P2X7)会导致构象变化,在有 ART2 表达的情况下,这种构象变化会使原初小鼠 T 细胞对胞外 NAD+ 敏感,从而导致凋亡 (9)。
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