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4006
Phospho-Na,K-ATPase α1 (Ser23) Antibody
一抗
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Phospho-Na,K-ATPase α1 (Ser23) Antibody #4006

引用 (5)
筛选器：
  1. WB
Western Blotting Image 1: Phospho-Na,K-ATPase α1 (Ser23) Antibody

使用 Phospho-Na,K-ATPase α1 (Ser23) Antibody (上图) 或总 Na/K ATPase α1 Antibody#3010(下图)，对未经处理或 TPA 处理的 PC-12 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

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4006S		 100 µl

定制制剂

支持数据

反应性 R
敏感性 内源性
MW (kDa) 100
来源 兔

应用缩写：

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10mM sodium HEPES（pH 为 7.5）、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析，在 4°C 下，将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育，轻晃孵育一整夜。

注意：请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测，蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
  14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号：10

特异性/敏感性

Phospho-Na,K-ATPase α1 (Ser23) Antibody 仅在 Ser23 磷酸化后可识别内源水平的 Na,K-ATPase α1。Ser23 残基编号是基于蛋白质未成熟形式的序列，对应于成熟切割形式的 Ser18。

物种反应性：

大鼠

来源/纯化

使用与大鼠 Na,K-ATPase α1 的 Ser23 周围残基相对应的合成磷酸肽，对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。使用蛋白 A 和肽亲和力色谱对抗体进行纯化。

背景

Na,K-ATP 酶属于 P 型 ATP 酶家族的整合型膜异二聚体。这种离子通道使用来自 ATP 水解的能量，通过逆电化学梯度跨质膜驱动钠输出和钾输入而维持膜电位。它由催化性 α 亚基和 β 亚基组成（综述参见 1）。已经鉴定出 α1 亚基的几个磷酸化位点。Tyr10 由一种尚未确定的激酶磷酸化 (2)，Ser16 和 Ser23 由 PKC 磷酸化，而 Ser943 由 PKA 磷酸化 (3-5)。所有这些位点均已涉及在激素和神经递质刺激下对酶活性的调节，从而改变 Na, K-ATP 酶的转运和动力学特性。血管紧张素 II 作用下改变的磷酸化可刺激大鼠近端小管中的活性 (6)。Na, K-ATP 酶还涉及其他信号转导通路。胰岛素调节其在分化的原代人骨骼肌细胞中的定位，并且这种调节作用取决于 α 亚基的 ERK1/2 磷酸化 (7)。Na, K-ATP 酶和 Src 可形成影响 Src 激酶活性调节过程并进而影响其下游效应物的信号转导受体复合体 (8,9)。

  1. Therien, A.G. and Blostein, R. (2000) Am J Physiol Cell Physiol 279, C541-66.
  2. Féraille, E. et al. (1999) Mol Biol Cell 10, 2847-59.
  3. Fisone, G. et al. (1994) J Biol Chem 269, 9368-73.
  4. Feschenko, M.S. and Sweadner, K.J. (1995) J Biol Chem 270, 14072-7.
  5. Beguin, P. et al. (1994) J Biol Chem 269, 24437-45.
  6. Yingst, D.R. et al. (2004) Am J Physiol Renal Physiol 287, F713-21.
  7. Al-Khalili, L. et al. (2004) J Biol Chem 279, 25211-8.
  8. Tian, J. et al. (2006) Mol Biol Cell 17, 317-26.
  9. Liang, M. et al. (2006) J Biol Chem 281, 19709-19.

通路和蛋白

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