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4947
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体

Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) Rabbit mAb #4947

引用 (335)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1: Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) Rabbit mAb

使用 Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) Rabbit mAb,对对照品经 plpC 转染 (1 小时) 的 HT29 和 THP1 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

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支持数据

反应性 H M
敏感性 内源性
MW (kDa) 45-55
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

特异性/敏感性

Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) Rabbit mAb 在 Ser396 磷酸化后可检测内源水平的 IRF-3。

物种反应性:

人, 小鼠

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

猴, 猪

来源/纯化

使用与人 IRF-3 的 Ser396 周围残基相对应的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

干扰素调节因子 (IRF) 包括一个转录因子家族,这些转录因子在 Jak/Stat 通路内部发挥作用以应答病毒性感染调节干扰素 (IFN) 和 IFN 诱导型基因表达 (1)。IRF 在病原体防御、自身免疫性、淋巴细胞发育、细胞生长和转化敏感性中发挥重要作用。IRF 家族包括九个成员:IRF-1、IRF-2、IRF-9/ISGF3γ、IRF-3、IRF-4 (Pip/LSIRF/ICSAT)、IRF-5、IRF-6、IRF-7 和 IRF-8/ICSBP。全部 IRF 蛋白均在其氨基末端 DNA 结合结构域共有同源性。IRF 家族成员通过与共有相似 DNA 结合基序(如 IFN 刺激反应元件 (ISRE)、IFN 共有序列 (ICS) 和 IFN 调节元件 (IRF-E))的蛋白质相互作用而调节转录 (2)。

IRF-3 可以抑制细胞生长并且在控制天然免疫应答中的基因表达方面发挥至关重要的作用 (1-4)。在未刺激的细胞中,IRF-3 存在于细胞浆中。病毒感染导致 IRF-3 的磷酸化并且导致其转运至胞核,在胞核,它激活含有 IRF-3 结合位点的启动子。IRF-3 磷酸化出现在羧基末端丝氨酸残基簇和苏氨酸残基簇(385和405之间)处,导致其结合促进 DNA 结合和转录活性的 p300/CBP 辅激活蛋白 (5)。在感染期间,IRF-3 可能会通过包括激活 Toll 样受体和包含 IKKε 和 TBK1 的激酶复合体的通路完成激活 (6,7)。IRF-3 在病毒感染、表达病毒核衣壳和双链 RNA 处理后在 Ser396 位点被磷酸化。这些事件可能在 IRF-3 激活中发挥作用 (8)。

  1. Taniguchi, T. et al. (2001) Annu Rev Immunol 19, 623-55.
  2. Honda, K. and Taniguchi, T. (2006) Nat Rev Immunol 6, 644-58.
  3. Hiscott, J. et al. (1999) J Interferon Cytokine Res 19, 1-13.
  4. Kim, T.Y. et al. (2003) J Biol Chem 278, 15272-8.
  5. Yoneyama, M. et al. (2002) J Interferon Cytokine Res 22, 73-6.
  6. Fitzgerald, K.A. et al. (2003) Nat Immunol 4, 491-6.
  7. Kopp, E. and Medzhitov, R. (2003) Curr Opin Immunol 15, 396-401.
  8. Servant, M.J. et al. (2003) J Biol Chem 278, 9441-7.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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