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67748
Phospho-CD3ζ (Tyr142) Antibody
一抗
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Phospho-CD3ζ (Tyr142) Antibody #67748

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Western Blotting Image 1: Phospho-CD3ζ (Tyr142) Antibody
使用 Phospho-CD3ζ (Tyr142) Antibody（上图）和 CD3ζ Antibody（下图）对未经 (-) 或已经 H2O2（11 mM，1 分钟；+）或交联抗 CD3 和抗 CD28（各 10 μg/mL，5 分钟；+）处理的血清饥饿 Jurkat 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。
Western Blotting Image 2: Phospho-CD3ζ (Tyr142) Antibody
使用 Phospho-CD3ζ (Tyr142) Antibody 对用同型对照 (-) 或交联抗 CD3 和抗-CD28（各 10 ug/mL，5 分钟；+）处理的血清饥饿 Jurkat 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。不用肽（左图），使用 CD3ζ (Tyr142) 非磷酸肽（中间）和 CD3ζ (Tyr142) 磷酸肽（右图）来预孵育抗体，以验证抗体的磷酸化特异性。
Western Blotting Image 3: Phospho-CD3ζ (Tyr142) Antibody
使用 Phospho-CD3ζ (Tyr142) Antibody（上图）和 CD3ζ Antibody（下图）对未经 (-) 或已经 H2O2（11 mM，1 分钟；+）处理的血清饥饿 Jurkat 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。如图所示，经 H2O2 处理的裂解物用牛小肠磷酸酶和 λ 磷酸酶（CIP/λ 磷酸酶；+）处理。
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67748S		 100 µl

定制制剂

支持性数据

反应性 H
灵敏度 内源性
MW (kDa) 20
来源 兔

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10mM sodium HEPES（pH 为 7.5）、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。‭

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹，在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜，同时柔和振摇。

注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测，进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O，混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ，混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液： 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ，混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
  14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：10

特异性/灵敏度

Phospho-CD3ζ (Tyr142) Antibody 可检测仅在 Tyr142 被磷酸化的 CD3ζ 蛋白的内源水平。该抗体不会与 65 kDa 的未知磷蛋白发生交叉反应。

物种反应性：

人

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种：

猪

来源/纯化

使用与人 CD3ζ 蛋白中 Tyr142 周围的残基相对应的合成磷酸肽对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。通过肽亲和色谱纯化抗体。

背景

当 T 细胞经 T 细胞受体 (TCR) 遭遇抗原时，抗原数量和性质信息将中继至胞内信号转导装置 (1)。该激活过程主要取决于直接与 TCR 结合的多亚基蛋白质复合体 CD3（分化抗原簇 3）。CD3 主要由四种多肽组成：ζ、γ、ε 和 δ。这些多肽各自包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的激活基序 (ITAM) (2)。TCR 复合体与外来抗原的接合在 ITAM 基序中诱导酪氨酸磷酸化，并且磷酸化的 ITAM 作为信号转导分子（如 ZAP-70 和 PI-3 激酶的 p85 亚基）的对接位点发挥作用 (3,4)。TCR 连接还在 CD3ε 中诱导构象变化，从而一个脯氨酸区暴露并且随后与接头蛋白 Nck 缔合 (5)。
CD3ζ 不变链是一种 I 型跨膜蛋白，作为一种二硫键连接的同型二聚体存在于 TCR 信号转导复合体中 (6)。每个 CD3ζ 单体的细胞浆尾区含三个不同的 ITAM 基序，每个 ITAM 基序含两个酪氨酸残基。CD3ζ ITAM 酪氨酸残基（包括 Y142）的磷酸化是由于 Lck 和 Fyn 酪氨酸激酶被募集到 TCR 引起的 (7)。Lck/Fyn 介导的 ITAM 磷酸化会生成能够促进 ZAP-70 发生 SH2 结构域依赖型募集和激活的停靠位点 (8-10)，这会促进 TCR 下游信号转导活动扩增，从而促进 T 细胞激活 (10)。较多 p16 CD3ζ 的磷酸化会产生 ITAM 磷酸化程度存在差异的 p21 和 p23 物种。现已提出 P21/p23 比值有助于调节 T 细胞激活的程度 (11)。CD3ζ 在 TCR 复合体的组装和表面表达中起到重要作用。确实，有研究表明，CD3ζ 在发生 Ag 依赖型 TCR 刺激时出现降解，这是紧密调控 T 细胞激活的一种机制 (12)。
  1. Kuhns, M.S. et al. (2006) Immunity 24, 133-139.
  2. Pitcher, L.A. and van Oers, N.S. (2003) Trends Immunol. 24, 554-560.
  3. Osman, N. et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26, 1063-1068.
  4. Hatada, M.H. et al. (1995) Nature 377, 32-38.
  5. Gil, D. et al. (2002) Cell 109, 901-912.
  6. Call, M.E. et al. (2006) Cell 127, 355-68.
  7. Housden, H.R. et al. (2003) Eur J Biochem 270, 2369-76.
  8. Hatada, M.H. et al. (1995) Nature 377, 32-8.
  9. Visco, C. et al. (2000) Biochemistry 39, 2784-91.
  10. Iwashima, M. et al. (1994) Science 263, 1136-9.
  11. Pitcher, L.A. et al. (2003) Immunol Rev 191, 47-61.
  12. Dumont, C. et al. (2002) J Immunol 169, 1705-12.

通路与蛋白质

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