反应性 | H M R Mk |
灵敏度 | 内源性 |
MW (kDa) | 50 |
来源/同种型 | 小鼠 IgG1 |
产品信息
应用 | 稀释度 |
---|---|
蛋白质印迹法 | 1:1000 |
免疫沉淀法 | 1:50 |
为了进行蛋白质印迹,在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜,同时柔和振摇。
注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。
注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。
* 避免反复接触皮肤。
发布时间 2005 年 6 月
修订时间 2020 年 6 月
实验步骤编号:262
本实验步骤适用于使用蛋白 G 磁性分离法对天然蛋白进行免疫沉淀,以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。
注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。
强烈建议进行细胞裂解物预清除步骤,以减少结合 Protein G Magnetic beads 的非特异性蛋白。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。
重要提示:使用前,预先洗涤 #70024 磁珠:
转移 20 μl 珠浆到一根干净的试管中。将试管放在磁分离架上 10-15 秒钟。
一旦溶液变澄清,便小心清除缓冲液。添加 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液到磁珠沉淀物中,稍微涡旋以洗涤珠子。将试管放回磁分离架。一旦溶液变澄清,便清除缓冲液。再次进行洗涤步骤。
重要提示:最佳裂解物浓度将取决于目的蛋白的表达水平。建议起始浓度为 250 μg/ml-1.0 mg/ml。
重要提示:强烈建议使用相应的同型对照,以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗,把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗,把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗,把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗,把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗,Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。
继续下述其中一项的具体步骤。
注意:当使用兔源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)作为二抗,以尽量减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白,建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127),以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。
当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗,以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。
发布时间 2008 年 12 月
修订时间 2021 年 10 月
实验步骤编号:121
人, 小鼠, 大鼠, 猴
使用与人 β 抑制蛋白 1 的 Ser412 周围残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。
Arrestin 蛋白是 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 信号转导的负调节因子。结合同源配体可刺激 GPCR 的磷酸化,随后抑制蛋白可结合至磷酸化的 GPCR 上,最后受体会内化,GPCR 信号转导脱敏 (1)。目前已经发现了四种不同的哺乳动物抑制蛋白。抑制蛋白1(也被称为 S-arrestin)和抑制蛋白4 (X-arrestin) 分别存在于视网膜圆柱细胞和视锥细胞中。Arrestin 2(也称为 β-arrestin 1)和 arrestin 3(β 抑制蛋白 2) 广泛表达,可与多数 GPCR 结合 (2)。作为接合体和骨架蛋白的 β-arrestin 在其他过程中起重要作用,如在 Erk 激活通路中募集 c-Src 家族蛋白至 GPCR (3,4)。β-arrestin 还在一些受体酪氨酸激酶信号通路中起作用 (5-8)。其他证据表明,β-arrestin 能转移到细胞核内,并通过结合到转录辅助因子上而调节转录 (9,10)。
Erk1/2 在羧基末端 Ser412 结构磷酸化 β 抑制蛋白 1,可促进支架蛋白的胞质定位 (11)。β2- 肾上腺素能受体的激动剂刺激可导致 β 抑制蛋白 1 募集至质膜,并使抑制蛋白迅速去磷酸化。去磷酸化是 β 抑制蛋白 1 介导产生受体内吞作用的一个重要步骤,但并非受体脱敏所必需 (12)。
探索与本品相关的通路。
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