反应性 | H M R |
灵敏度 | 内源性 |
MW (kDa) | 72 |
来源/同种型 | 兔 IgG |
产品信息
应用 | 稀释度 |
---|---|
蛋白质印迹法 | 1:1000 |
免疫沉淀法 | 1:200 |
为了进行蛋白质印迹,在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜,同时柔和振摇。
注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。
从样品制备至检测,进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。
注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。
* 避免反复接触皮肤。
发布时间 2005 年 6 月
修订时间 2020 年 6 月
实验步骤编号:10
本实验步骤适用于使用 Protein A agarose beads 对天然蛋白进行免疫沉淀,以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。
注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。
重要提示:强烈建议使用相应的同型对照,以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗,把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗,把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗,把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗,把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗,Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。
继续下述其中一项的具体步骤。
注意:当使用兔源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)作为二抗,以尽量减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白,建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127),以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。
当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗,以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。
发布时间 2008 年 12 月
修订时间 2021 年 10 月
实验步骤编号:409
人, 小鼠, 大鼠
使用与人 Atg13 蛋白中 Ser355 周围的残基相对应的合成磷酸肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。该位点对应于 Atg13 的异构体2的 Ser318。
自噬是自噬溶酶体降解大部分细胞浆内容物的一种分解代谢过程 (1,2)。通常在营养剥夺条件下激活自噬,但自噬也与一些生理过程有关,如发育、分化、神经变性、感染和癌症 (3)。已在酵母中大量发现自噬的分子机制,被称为自噬基因 (Atg)。
Atg13/Apg13 最初作为一种结构性表达蛋白发现于酵母中,这种蛋白在基因层面与 Atg1/Apg1 相连,后者是自噬所需的一种蛋白激酶 (4)。Atg1 过表达会抑制在 Atg13 突变体中观察到的自噬缺陷 (4)。自噬过程需要 Atg1 与 Atg13 之间的直接结合,并且在高营养条件下受 Atg13 的 TOR 依赖性磷酸化的抑制 (5)。同样,哺乳动物的 Atg13 与 Atg1 同源蛋白 ULK1/2 和 FIP200 形成一个复合体,该复合体定位至自噬隔离膜并调节自噬体的生物合成 (6-8)。mTOR 磷酸化 Atg13 和 ULK1,进而抑制 ULK1 激酶活性和自噬 (7-9)。ULK1 可在一个尚未鉴定的位点直接磷酸化 Atg13,推测其可促进自噬 (7,8)。其他研究表明,Atg13 和 FIP200 的作用不受 ULK1 和 ULK2 的影响,并通过一种未知机制诱导自噬 (10)。
Atg13 于 Ser355 位点 (对应于 Atg13 同工型2的 Ser318) 发生 ULK1 依赖性磷酸化,可使得 Atg13 募集至受损的线粒体中,从而保证有效的自噬过程 (11)。
探索与本品相关的通路。
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