Phospho-Akt (Ser473) (736E11) Rabbit mAb #3787

免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

1. 二甲苯
2. 乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）
3. 去离子水 (dH₂O)
4. Hematoxylin（可选）
5. 洗涤缓冲液：
   1. 含 Tween^® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween^® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH₂0 中并混合。
6. SignalStain^® Antibody Diluent (#8112)。
7. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH₂O 中。
8. 3% 过氧化氢：要制备，添加10 ml 30% H₂O₂至90 ml dH₂O 中。
9. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
   1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
   2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备 4 mL of dH₂O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
10. 检测系统： VECTASTAIN^® Elite ABC，包括生物素化二抗 (Vector Laboratories)。
11. 底物：Vector^® NovaRED™ (Vector Laboratories)。
12. 苏木精： Hematoxylin (#14166)。
13. 封片剂： SignalStain^® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐：将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
5. 在每个切片上滴加 100–400 µl 首选封闭液，在室温下封闭 1 小时。
6. 除去封闭液，并给每块切片添加 100-400 µl 在 SignalStain^® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 温度下孵育过夜。
7. 根据制造商建议说明制备 ABC 溶液。
8. 清除一抗，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
9. 将每个切片中添加 100-400 µl 生物素化二抗（根据制造商建议在 TBST 中进行稀释）。在室温孵育 30 分钟。
10. 清除二抗溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
11. 按需使用 100-400 µl 预混合 ABC 溶液覆盖切片，并在湿盒中室温孵育 30 分钟。
12. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
13. 根据制造商建议说明制备 Vector^® NovaRED™。
14. 在每张切片上应用 100–400 µl 底物并密切观察，通常 1-10 分钟即可得到合适的染色强度。
15. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
16. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
17. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
18. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

注意：使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗，考虑到检测试剂的不同灵敏度。