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84214
Phospho-α-Adducin (Ser12) (E5X8Y) Rabbit mAb
一抗
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Phospho-α-Adducin (Ser12) (E5X8Y) Rabbit mAb #84214

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Western Blotting Image 1: Phospho-α-Adducin (Ser12) (E5X8Y) Rabbit mAb

使用 Phospho-α-Adducin (Ser12) (E5X8Y) Rabbit mAb（上图）、α-Adducin (D7T7R) Rabbit mAb #70174（中图）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图），对经过胸苷（2 mM, 17 小时）处理并释放到新鲜培养基中达 8 小时，然后再次用胸苷（2 mM，17 小时）（双胸腺嘧啶核苷）处理，随后进行细胞裂解（胸腺嘧啶/胸腺嘧啶核苷）或释放到包含 100 ng/mL Nocodazole #2190 的培养基中达 24 小时（胸苷/胸苷/nocodazole）的 HT-29 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

Immunoprecipitation Image 1: Phospho-α-Adducin (Ser12) (E5X8Y) Rabbit mAb

用 Nocodozole #2190（100 ng/mL，16 小时）对经过处理的 HT-29 细胞提取物中的磷酸化 α-adducin（Ser12）蛋白进行免疫沉淀分析，以富集有丝分裂中的细胞。泳道 1 为 10% input，泳道 2 为 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900，泳道 3 为 Phospho-α-Adducin (Ser12) (E5X8Y) Rabbit mAb。使用进行蛋白质印迹分析。

Phospho-α-Adducin (Ser12) (E5X8Y) Rabbit mAb。

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84214S		 100 µl

定制制剂

支持数据

反应性 H
敏感性 内源性
MW (kDa) 120
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写：

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫沉淀 1:100

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。不要分装抗体。‭

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析，在 4°C 下，将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育，轻晃孵育一整夜。

注意：请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测，蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa)：(#13953)。
  14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#13953，5 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号：10

天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于使用 Protein A agarose beads 对天然蛋白进行免疫沉淀，以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS，将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O 中并混合。

  2. 10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O，并混合。

    注意：使用前，请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

  3. 3X SDS上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。
  4. Protein A Agarose Beads：(#9863)。
  5. 10X 激酶缓冲液（用于激酶试验）：(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  6. ATP (10 mM)（用于激酶试验）：(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM)，将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。
  6. 在 4°C，在 14,000 x g 条件下，微量离心 10 分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清（可选）

  1. 涡旋振荡，以混合磁珠。
  2. 添加 10–30 µl 的 50% Protein A agarose beads 混悬液至 200 µl 细胞裂解物中 (1 mg/ml)。
  3. 在 4°C 下，旋转孵育 30–60 分钟。
  4. 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
  5. 继续以下的免疫沉淀法。

免疫沉淀

  1. 将一抗（按产品说明书中推荐的合适稀释比例配制）加入到浓度为 1 mg/ml 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下，旋转孵育过夜。
  2. 添加 protein A 琼脂糖（10–30 µl 的 50% 珠浆）。在 4°C 下，旋转孵育 1-3 小时。
  3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
  4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活性检测对样品进行分析（D 部分）。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 对于 SDS-PAGE，将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注意：为了最大限度减少变性 IgG 重链产生的遮盖作用 (~50 kDa)，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa)，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）

用激酶活性测定法进行分析

  1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

发布​于 2008 年 12 月 

修订于 2018 年 4 月

实验步骤编号：409

特异性/敏感性

仅在 Ser12 位点被磷酸化时，Phospho-α-Adducin (Ser12) (E5X8Y) Rabbit mAb 才能识别 α-adducin 蛋白的内源水平。在某些细胞系中，该抗体可能会与未知来源的 150 kDa 条带发生交叉反应。该条带似乎在有丝分裂中被上调。

物种反应性：

人

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种：

小鼠, 大鼠

来源/纯化

使用与人 α-adducin 蛋白的 Ser12 周围残基相对应的合成肽，对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

内收蛋白 (ADD) 为细胞骨架相关的蛋白，可帮助盖帽肌动蛋白丝的末端，促进血影蛋白与肌动蛋白之间的结合并参与突触组合。三种密切相关的基因 ADD1、ADD2 和 ADD3 可编码 α-adducin、β-adducin 和 γ-adducin 蛋白 (1)。研究表明，β-adducin 在脑和造血组织的水平较高，而 α-adducin 和 γ-adducin 均广泛表达 (2)。内收蛋白功能受多个位点的磷酸化调节。PKA 和 PKC 均可在 Ser726 位点（β-adducin 在 Ser713 位点）磷酸化 α-adducin，从而抑制钙调蛋白结合和内收蛋白活性 (3-5)。此外，PKA（而非 PKC）可在 Ser408、Ser436 和 Ser481 位点磷酸化 β-adducin，从而对血影蛋白-肌动蛋白相互作用造成消极影响 (3)。α-adducin 在 Thr445 和 Thr480 位点被 Rho-kinase 磷酸化可调节细胞运动和膜边缘波动 (6)。最后，有丝分裂期间 CDK-1 在 Ser12 和 Ser355 位点对 α-adducin 的磷酸化导致 α-adducin 与有丝分裂纺锤体结合，说明 α-adducin 可能在有丝分裂调节中发挥作用 (7)。由于 α-adducin 在调节肾钠重吸收中发挥作用，因此许多研究表明 ADD1 基因多态性和高血压发病有关并不足为奇 (8-10)。

  1. Matsuoka, Y. et al. (2000) Cell Mol Life Sci 57, 884-95.
  2. Joshi, R. et al. (1991) J Cell Biol 115, 665-75.
  3. Matsuoka, Y. et al. (1996) J Biol Chem 271, 25157-66.
  4. Chen, C.L. et al. (2007) J Cell Sci 120, 1157-67.
  5. Naydenov, N.G. and Ivanov, A.I. (2010) Mol Biol Cell 21, 3506-17.
  6. Fukata, Y. et al. (1999) J Cell Biol 145, 347-61.
  7. Chan, P.C. et al. (2014) J Cell Biol 204, 19-28.
  8. Kalita, J. et al. (2013) Neurol Res 35, 429-34.
  9. Kundu, A. and Anand, A. (2013) Cell Biochem Biophys 65, 13-9.
  10. Watanabe, Y. et al. (2010) Hypertens Res 33, 129-34.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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