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Phospho-14-3-3 ζ/δ (Ser58)/η (Ser59)/γ (Ser59)/β/α (Ser60) (E6B3G) Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体
R
重组

Phospho-14-3-3 ζ/δ (Ser58)/η (Ser59)/γ (Ser59)/β/α (Ser60) (E6B3G) Rabbit mAb #52631

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筛选器:
  1. WB
使用 Phospho-14-3-3 ζ/δ (Ser58)/η (Ser59)/γ (Ser59)/β/α (Ser60) (E6B3G) Rabbit mAb(上图)和 14-3-3 ζ/δ (D7H5) Rabbit mAb #7413(下图)对未经 (-) 或已经 IBMX #13630(50 uM;+)和 Forskolin #3828(30 分钟;+)处理的 HeLa 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。
To Purchase # 52631S
目录# 规格 价格 库存
52631S
100 µl

支持性数据

反应性 H M R
灵敏度 内源性
MW (kDa) 28
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。‭

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹,在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜,同时柔和振摇。

注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测,进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS:将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O,混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS):(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS:将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ,混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液,配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液: 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ,混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

特异性/灵敏度

Phospho-14-3-3 ζ/δ (Ser58)/η (Ser59)/γ (Ser59)/β/α (Ser60) (E6B3G) Rabbit mAb 可检测仅在 Ser58 被磷酸化的 14-3-3 ζ/δ、仅在 Ser59 被磷酸化的 14-3-3 η 和 14-3-3 γ 以及仅在 Ser60 被磷酸化的 14-3-3 α/β 的内源水平。该抗体不会与 14-3-3 ε、14-3-3 θ 或 14-3-3 σ 发生交叉反应。该抗体还可检测 80 kDa 和 180 kDa 的未知非特异性条带。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

猴, 鸡 , 牛 , 猪

来源/纯化

使用与人 14-3-3 ζ/δ 蛋白中 Ser58 周围的残基相对应的合成磷酸肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

14-3-3 家族蛋白在信号转导、检查点控制、凋亡和营养感应通道 (1,2) 中起到关键调节作用。14-3-3 蛋白高度保守且表达广泛。已经在哺乳动物内发现了至少 7 个亚型 β、γ、ε、σ、ζ、τ 和 η。最初发现的 α 和 δ 亚型已经证明分别是 β 和 ζ 亚型的磷酸化形式 (3)。通过它们的氨基末端 α 螺旋区域,14-3-3 蛋白可形成同源或异源二聚体,这些二聚体与包括转录因子、新陈代谢酶、细胞支架蛋白、激酶、磷酸化酶在内的很多蛋白质和其它信号分子发生相互作用 (3,4)。14-3-3 蛋白和其他靶标蛋白间的相互作用主要是通过一个磷酸化的丝氨酸/苏氨酸基序完成的。但是,据观察该蛋白也能够和不同的磷酸化丝氨酸/苏氨酸基序结合,以及呈现磷酸化非依赖性的相互作用 (4)。14-3-3 的结合会遮蔽掉靶标蛋白的特殊序列进而影响靶标蛋白的定位,磷酸化状态,稳定性和分子间相互作用 (1-4)。14-3-3 蛋白也可诱导靶标蛋白的构象变化以影响靶标蛋白的功能 (4,5)。在发育和应对细胞外信号和药物的急性反应期发现了不同 14-3-3 蛋白亚型的时空表达模式,表明尽管 14-3-3 蛋白亚型的序列相似,它们可能具有不同的功能 (4)。若干研究表明 14-3-3 亚型在癌症和神经性疾病中受到不同的调控 (2,3)。
14-3-3ζ 在 Ser58 的磷酸化可调节二聚化,并影响其与 p53 和 ASK1 等伴侣蛋白相互作用的能力 (6,7)。

通路

探索与本品相关的通路。

有限使用

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