Na,K-ATPase α1 (D4Y7E) Rabbit mAb #23565

蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹，在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween^® 20 中稀释的一抗孵育过夜，同时柔和振摇。

注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测，进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH₂O，混合。
2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH₂O ，混合。
3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH₂O 稀释至 1X。
4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液： 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH₂O ，混合。
5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH₂O 中，并混合。
6. 含有 Tween^® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH₂O 中并混合。
7. 脱脂奶粉：(#9999)。
8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
6. 微量离心机内离心 5 分钟。

7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

   注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm²) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 二甲苯。
2. 无水变性乙醇，组织级（100% 和 95%）。
3. 去离子水 (dH₂O)。
4. 苏木精（可选）。
5. 洗涤缓冲液：
   1. 含 Tween^® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween^® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH₂0 中并混合。
6. SignalStain^® Antibody Diluent (#8112)。
7. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH₂O 中。
8. 3% 过氧化氢：要制备 100 ml，添加 10 ml 30% H₂O₂ 至 90 ml dH₂O 中。
9. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
   1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
   2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备 4 mL of dH₂O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
10. 检测系统：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
11. 底物：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059)。
12. 苏木精： Hematoxylin (#14166)。
13. 封片剂： SignalStain^® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐：将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
6. 去除封闭液，并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain^® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
7. 使 SignalStain^® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
8. 清除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain^® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain^® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain^® DAB Diluent 中，使用前充分混合。
12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain^® DAB，并密切观察，通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
13. 将切片浸入 dH₂O 中。
14. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
15. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
16. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

注意：使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗，考虑到检测试剂的不同灵敏度。

免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
3. 甲醇，100%
4. 封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如 Normal Goat Serum (#5425)）和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH₂O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
5. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (9998)，并混合。

6. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗：

   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #8889
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414
7. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。注意：甲醛有毒性，仅可在通风橱中使用
2. 室温下固定细胞 15 分钟。
3. 吸去固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 甲醇通透步骤：在细胞上覆盖冰冷的 100% 甲醇（使用足够的甲醇完全覆盖至 3–5 mm，不要让其干燥），并在 –20°C 下用甲醇孵育 10 分钟，同时用 1X PBS 漂洗 5 分钟。
2. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
3. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
4. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
5. 4°C 温度下孵育过夜。
6. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
7. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
8. 按步骤 6 使用 1X PBS 漂洗。
9. 使用 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong^® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
10. 为达到最佳效果，立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。