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N6-Methyladenosine (m6A) (D9D9W) Rabbit mAb
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N6-Methyladenosine (m6A) (D9D9W) Rabbit mAb #56593

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N6-Methyladenosine (m6A) (D9D9W) Rabbit mAb: Image 1

N6-甲基腺苷 (m6A) (D9D9W) Rabbit mAb 的特异性通过 ELISA 进行确定。对含未修饰腺苷或 N6-甲基化腺苷 (m6A) 的 RNA 寡核苷酸滴定该抗体。如图表所示，该抗体只结合 N6-甲基化腺苷 (m6A)。

N6-Methyladenosine (m6A) (D9D9W) Rabbit mAb: Image 2

N6-甲基腺苷 (m6A) (D9D9W) Rabbit mAb 的特异性通过竞争性 ELISA 进行确定。该图表描绘了在不同修饰腺苷浓度递增的情况下抗体与预包被 m6A 寡核苷酸的结合。如图表所示，抗体结合仅会被游离 m6A 核苷阻断。

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支持数据

反应性 所有物种
敏感性 内源性
MW (kDa)
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写：

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

一个独立实验室的实验表明，该抗体在 RNA-IP-seq 中有效。请按实验决定的稀释度使用。

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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RNA 点印迹实验步骤

A. 缓冲液和试剂

  1. 20X 柠檬酸钠盐水 (SSC) 缓冲液： 3.0 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠，pH 至 7.0。
  2. 10X SSc 缓冲液： 1:2 稀释 20X SSC 缓冲液。
  3. 4X RNA变性缓冲液： 16.4M 甲酰胺、2.8 M 甲醛，26.6 mM MOPS 缓冲液（6.7 mM 乙酸钠、1.3 mM EDTA、1.3 mM EGTA）。
  4. 无核酸酶的水： (#12931)
  5. 印迹膜：本实验步骤已针对带正电荷的尼龙膜进行优化。
  6. 96 孔点印迹仪器
  7. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  8. 脱脂奶粉： ( #9999)
  9. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加至 20 ml 1X TBST 并充分混合。
  12. HRP 偶联二抗：抗兔 (#7074)；抗小鼠 (#7076)。
  13. 检测试剂 LumiGLO® 化学发光试剂和过氧化氢 (#7003) 或 SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 点印迹

注：编写本实验步骤是为了使用 96 孔点印迹仪，将纯化的总 RNA 或 poly A 纯化的 mRNA（滴定度为 2 ng、1 μg、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng 和 31.25 ng）点样到带正电荷的尼龙膜上。根据 RNA 的来源，用抗体检测可能需要更多或更少的 RNA。

启动前：
• RNA 对 RNase 降解敏感，RNA 降解会影响样品的完整性。建议所有表面和设备都经过 RNase 净化处理。• 使用 RNA 分离试剂盒从细胞沉淀物中纯化总 RNA 和/或 mRNA。通过在 1％ 琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳来评估总 RNA 的质量。28S 和 18S RNA 应该呈现为不同的条带。涂片表明 RNA 降解。参见图 1。• 将一片尼龙膜切割成点印迹多管吸印仪的尺寸。
• 用 10X SSC 缓冲液润湿尼龙膜。• 通过在 96 孔点印迹仪中放置尼龙膜并施加真空，使其干燥。

  1. 在 50 μl 无核酸酶的水中将 RNA 稀释至 160 ng/μl。通过添加 16.5 μl 4X RNA 变性缓冲液，并在 65°C 孵育 5 分钟，使 RNA 变性。
  2. 添加66.5 μl 20X SSC 缓冲液，并且立即在冰上速冷 5 分钟。
  3. 添加67 μl 无核酸酶的水以补足 DNA 溶液至终体积 200 μl，RNA 浓度为 40 ng/μl。
  4. 使用步骤 3 中的 RNA 溶液，添加等量的 RNA 溶液至无核酸酶的水中，建立六份 2 倍连续稀释物。这将生成 7 个 RNA 样本，其浓度分别为 40、20、10、5、2.5、1.25 和 0.625 ng/μl。
  5. 从 7 份稀释物样品中各取 50 μl 至 96 孔点印迹仪的单个孔中，留下最后一孔添加无核酸酶的水。随后，每个孔的 RNA 添加量应分别为 2 ng、1 μg、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng 和 0 ng。施加柔和真空压力以将溶液过膜引出。尼龙膜在 步骤6 之前应几乎全干。
  6. 从 96 孔点印迹仪取下尼龙膜并且包裹在保鲜膜中。
  7. 在 1200 J/m2处将尼龙膜 UV 交联。
  8. 重复步骤 7 以进行第二轮 UV 交联。

C. 膜封闭和抗体孵育

可选：要使用亚甲基蓝标准化样品加载，请在 C 节第 1 步之前涂上染色剂并拍摄图像。用 15 mL dH 2 O 漂洗三次，每次 5 分钟。染色不影响抗体结合或检测。

  1. 将膜在室温于 25 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
  2. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 将膜和一抗（按照抗体产品数据表中建议的适当稀释度和稀释剂）在4°C 于 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育过夜，同时温和振荡。
  4. 用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 将膜与合适的 HRP 偶联二抗（#7074 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 或 #7076 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody）按 1:2000 在室温于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
  6. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  7. 继续进行检测（D 部分）。

D. RNA 的检测

  1. 将膜与 10 mL LumiGLO®（0.5 ml 20x LumiGLO® #7003、0.5 ml 20x 过氧化物和 9.0 ml 净化水）或 10 ml SignalFire™ #6883（5 ml 试剂 A，5 ml 试剂 B）在室温孵育 1 分钟，同时温和振荡。
  2. 排干多余的显影液膜（不要让其干燥），包上保鲜膜，然后使用化学发光敏感的检测方法（胶片曝光或数字成像仪）捕获图像。

注：由于检测反应的动力学，信号在孵育后最强并且在后续 2 小时内减弱。

Figure 1. Representative image of isolated, intact total RN

图 1. 分离的、完整的总 RNA 的代表性图像。28S 和 18S RNA 应迁移为不同的条带。如果 RNA 表现为涂片，则样品可能会降解，不适合用于下游测定。泳道 1 是 NEB 100 bp DNA 阶梯，泳道 2 是从 293T 细胞分离的总 RNA。


发布​于 2018 年 11 月 

实验步骤编号：1784

特异性/敏感性

N6-Methyladenosine (m6A) (D9D9W) Rabbit mAb 可检测内源水平的 N6-甲基腺苷 (m6A) 。该抗体使用 ELISA 和斑点印迹实验进行了验证，并且表明对 m6A 有高特异性。该抗体不会与未修饰的腺苷、N6-二甲基腺苷、N1-甲基腺苷或 2'-O-甲基腺苷发生交叉反应。

物种反应性：

预期的所有物种

来源/纯化

使用 N6-甲基腺苷对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

N6-甲基腺苷 (m6A) 是一种在多个 RNA 亚型中发现的转录后修饰。虽然几十年前就发现了 RNA 中存在 m6A，但工具的缺乏使得表观转录组环境研究变得具有挑战性 (1,2)。随着 miCLIP 和 NG-RNA-seq 等新技术的出现，研究人员已经能够发现 m6A 是 mRNA 中的一种生物相关标记，并在 3’ UTR 和终止密码子中富集 (3,4)。m6A 写入蛋白复合体包含甲基转移酶样蛋白 3 (METTL3) 和甲基转移酶样蛋白 14 (METTL14) 的核心异二聚体，以及 Virlizer/VIRMA 和肾母细胞瘤 (Wilms tumor) 1 相关蛋白 (WTAP) 等其他调节蛋白 (5)。METTL3 是催化甲基转移酶亚基，而 METTL14 则是结合 RNA 的靶标识别亚基 (6)。Virilzer/VIRMA 蛋白将 m6A 甲基化导向至 3’ UTR 和终止密码子，WTAP 将复合体靶向胞核小点（RNA 加工位点）(7)。有关 m6A 读取蛋白和擦除蛋白的信息知之甚少，虽然脂肪量和肥胖相关蛋白 FTO 是最先发现的 m6A 去甲基化酶，但随后的研究证明这种酶在体内可能更倾向于密切相关的 m6Am 标记 (8,9)。后来证明，ALKBH5 是一种真正的 m6A 去甲基化酶，因此得出 m6A 修饰是动态调控的结论 (10)。m6A 标记的读取蛋白包括 YTH 蛋白家族，这个家族结合 m6A 并影响 mRNA 稳定性和翻译效率 (3,11-13)。m6A 标记和分子组经证实可调节各种细胞功能，包括 RNA 剪切、翻译调控、多能性和细胞命运决定、神经元功能及疾病 (1, 14-17)。m6A 写入蛋白复合体与 AML 和子宫内膜癌等各种癌症类型有关 (18,19)。此外，m6A 与化疗耐药性有关20)。

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