N6-Methyladenosine (m6A) (D9D9W) Rabbit mAb #56593

RNA 点印迹实验步骤

A. 缓冲液和试剂

1. 20X 柠檬酸钠盐水 (SSC) 缓冲液： 3.0 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠，pH 至 7.0。
2. 10X SSc 缓冲液： 1:2 稀释 20X SSC 缓冲液。
3. 4X RNA变性缓冲液： 16.4M 甲酰胺、2.8 M 甲醛，26.6 mM MOPS 缓冲液（6.7 mM 乙酸钠、1.3 mM EDTA、1.3 mM EGTA）。
4. 无核酸酶的水： (#12931)
5. 印迹膜：本实验步骤已针对带正电荷的尼龙膜进行优化。
6. 96 孔点印迹仪器
7. 含有 Tween^® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH₂O 中并混合。
8. 脱脂奶粉： ( #9999)
9. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)
11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加至 20 ml 1X TBST 并充分混合。
12. HRP 偶联二抗：抗兔 (#7074)；抗小鼠 (#7076)。
13. 检测试剂 LumiGLO^® 化学发光试剂和过氧化氢 (#7003) 或 SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 点印迹

注：编写本实验步骤是为了使用 96 孔点印迹仪，将纯化的总 RNA 或 poly A 纯化的 mRNA（滴定度为 2 ng、1 μg、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng 和 31.25 ng）点样到带正电荷的尼龙膜上。根据 RNA 的来源，用抗体检测可能需要更多或更少的 RNA。

启动前：
• RNA 对 RNase 降解敏感，RNA 降解会影响样品的完整性。建议所有表面和设备都经过 RNase 净化处理。• 使用 RNA 分离试剂盒从细胞沉淀物中纯化总 RNA 和/或 mRNA。通过在 1％ 琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳来评估总 RNA 的质量。28S 和 18S RNA 应该呈现为不同的条带。涂片表明 RNA 降解。参见图 1。• 将一片尼龙膜切割成点印迹多管吸印仪的尺寸。
• 用 10X SSC 缓冲液润湿尼龙膜。• 通过在 96 孔点印迹仪中放置尼龙膜并施加真空，使其干燥。

1. 在 50 μl 无核酸酶的水中将 RNA 稀释至 160 ng/μl。通过添加 16.5 μl 4X RNA 变性缓冲液，并在 65°C 孵育 5 分钟，使 RNA 变性。
2. 添加66.5 μl 20X SSC 缓冲液，并且立即在冰上速冷 5 分钟。
3. 添加67 μl 无核酸酶的水以补足 DNA 溶液至终体积 200 μl，RNA 浓度为 40 ng/μl。
4. 使用步骤 3 中的 RNA 溶液，添加等量的 RNA 溶液至无核酸酶的水中，建立六份 2 倍连续稀释物。这将生成 7 个 RNA 样本，其浓度分别为 40、20、10、5、2.5、1.25 和 0.625 ng/μl。
5. 从 7 份稀释物样品中各取 50 μl 至 96 孔点印迹仪的单个孔中，留下最后一孔添加无核酸酶的水。随后，每个孔的 RNA 添加量应分别为 2 ng、1 μg、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng 和 0 ng。施加柔和真空压力以将溶液过膜引出。尼龙膜在 步骤6 之前应几乎全干。
6. 从 96 孔点印迹仪取下尼龙膜并且包裹在保鲜膜中。
7. 在 1200 J/m²处将尼龙膜 UV 交联。
8. 重复步骤 7 以进行第二轮 UV 交联。

C. 膜封闭和抗体孵育

可选：要使用亚甲基蓝标准化样品加载，请在 C 节第 1 步之前涂上染色剂并拍摄图像。用 15 mL dH ₂ O 漂洗三次，每次 5 分钟。染色不影响抗体结合或检测。

1. 将膜在室温于 25 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
2. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 将膜和一抗（按照抗体产品数据表中建议的适当稀释度和稀释剂）在4°C 于 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育过夜，同时温和振荡。
4. 用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
5. 将膜与合适的 HRP 偶联二抗（#7074 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 或 #7076 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody）按 1:2000 在室温于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
6. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
7. 继续进行检测（D 部分）。

D. RNA 的检测

1. 将膜与 10 mL LumiGLO^®（0.5 ml 20x LumiGLO^® #7003、0.5 ml 20x 过氧化物和 9.0 ml 净化水）或 10 ml SignalFire™ #6883（5 ml 试剂 A，5 ml 试剂 B）在室温孵育 1 分钟，同时温和振荡。
2. 排干多余的显影液膜（不要让其干燥），包上保鲜膜，然后使用化学发光敏感的检测方法（胶片曝光或数字成像仪）捕获图像。

注：由于检测反应的动力学，信号在孵育后最强并且在后续 2 小时内减弱。

图 1. 分离的、完整的总 RNA 的代表性图像。28S 和 18S RNA 应迁移为不同的条带。如果 RNA 表现为涂片，则样品可能会降解，不适合用于下游测定。泳道 1 是 NEB 100 bp DNA 阶梯，泳道 2 是从 293T 细胞分离的总 RNA。