反应性 | H M |
灵敏度 | 内源性 |
MW (kDa) | 140 |
来源/同种型 | 兔 IgG |
产品信息
应用 | 稀释度 |
---|---|
蛋白质印迹法 | 1:1000 |
免疫沉淀法 | 1:50 |
IHC Leica BOND | 1:25 - 1:100 |
免疫组织化学(石蜡) | 1:50 - 1:200 |
免疫荧光法(免疫细胞化学) | 1:400 - 1:1600 |
为了进行蛋白质印迹,在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜,同时柔和振摇。
注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。
从样品制备至检测,进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。
注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。
* 避免反复接触皮肤。
发布时间 2005 年 6 月
修订时间 2020 年 6 月
实验步骤编号:10
本实验步骤适用于使用 Protein A agarose beads 对天然蛋白进行免疫沉淀,以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。
注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。
重要提示:强烈建议使用相应的同型对照,以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗,把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗,把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗,把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗,把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗,Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。
继续下述其中一项的具体步骤。
注意:当使用兔源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)作为二抗,以尽量减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白,建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127),以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。
当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗,以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。
发布时间 2008 年 12 月
修订时间 2021 年 10 月
实验步骤编号:409
注:请参阅产品数据表或产品网页,了解合适的抗体稀释度^。
步骤 | 试剂 | 时间/温度 | |
---|---|---|---|
1 | 脱蜡 | BOND™ Dewax Solution、100% 乙醇、BOND™ Wash Solution | 预编程的 Leica® BOND™ |
2 | 抗原修复 | BOND™ Epitope Retrieval ER2 Solution | 20 分钟,100˚C | 实验步骤:用 ER2 进行 20 分钟的热诱导表位修复 (HIER) |
3 | 过氧化物封闭液 | Refine Detection Kit Peroxide Block* | 5 分钟 |
洗涤 | BOND™ Wash Solution | 3x 0:00 分钟 | |
4 | 蛋白封闭液(可选) | #5425 NGS 或 #15019 Animal-Free Blocking Solution | 20 分钟 |
5 | 一抗^ | 用 #8112 SignalStain® Antibody Diluent 稀释 | 30 分钟 |
洗涤 | BOND™ Wash Solution | 3x 2:00 分钟 | |
不适用 | Post Primary Mouse Linker | Refine Detection Kit Post Primary* | 不适用 |
6 | 二次检测 | Refine Detection Kit Polymer* | 10 分钟 |
洗涤 | BOND™ Wash Solution/Deionized Water | 定制(参见下文) | |
7a | 可视化 | Refine Detection Kit Mixed DAB Refine* | 0:00 分钟 |
7b | 可视化 | Refine Detection Kit Mixed DAB Refine* | 10 分钟 |
洗涤 | 去离子水 | 3x 0:00 分钟 | |
8 | 复染 | Refine Detection Kit Hematoxylin* | 5 分钟 |
洗涤 | 去离子水 | 0:00 分钟 | |
洗涤 | BOND™ Wash Solution | 0:00 分钟 | |
洗涤 | 去离子水 | 0:00 分钟 | |
9 | 脱水(离线): | ||
在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。 | |||
在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。 | |||
在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。 | |||
10 | 用盖玻片和 #14177 SignalStain® Mounting Medium 封片。 | ||
可选订制洗涤: | BOND™ Wash Solution | 2:00 | |
BOND™ Wash Solution | 分液器类型:开放式 0:00 | ||
BOND™ Wash Solution | 2:00 | ||
BOND™ Wash Solution | 分液器类型:开放式 0:00 | ||
BOND™ Wash Solution | 0:00 | ||
去离子水 | 0:00 |
*BOND™ Polymer Refine Detection Kit(货号:DS9800)中所含的试剂
LEICA® 是 Leica Microsystems IR GmbH 的注册商标。
BOND™ 是 Leica Biosystems Melbourne Pty. Ltd 的商标。CST 和 Leica Microsystems IR GmbH 或 Leica Biosystems Melbourne Pty. Ltd 之间没有附属或赞助关系。
发布时间 2018 年 8 月
修订时间 2018 年 9 月
实验步骤编号:1444
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。
对于柠檬酸盐:将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。
推荐的 检测试剂 |
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 | SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653 |
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兼容的 色原 |
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 | SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713 |
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632 | SignalStain® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit #12824 | |
SignalStain® Deep Black Peroxidase Substrate Kit #72986 | ||
SignalStain® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit #69644 |
注意:使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗,考虑到检测试剂的不同灵敏度。
发布时间 2010 年 2 月
修订时间 2020 年 6 月
实验步骤编号:283
若想获得高质量的免疫荧光图片,请使用我们 #12727 Immunofluorescence Application Solutions Kit 中高效且划算的预制试剂。
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
建议使用偶联荧光素的抗兔二抗:
注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。
吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。
注意:甲醛有毒性,需在通风橱中使用。
注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。
发布时间 2006 年 11 月
修订时间 2013 年 11 月
实验步骤编号:24
人, 小鼠
使用与人类 N-cadherin 蛋白 Arg526 周围的残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。
钙黏着蛋白是在其胞外结构域中含有大约 100 个残基的钙黏着蛋白重复序列的跨膜糖蛋白超家族。钙黏着蛋白介导钙依赖性细胞-细胞黏附,并在正常组织发育中发挥至关重要的作用 (1)。经典的钙黏着蛋白亚家族包括 N-、P-、R-、B- 和 E-钙黏着蛋白,以及约十个在黏附连接中存在的其他成员,黏附连接是一种在极化上皮细胞顶面的细胞结构。经典钙黏着蛋白的胞质结构域可与 β-联蛋白、γ-联蛋白(也称作斑珠蛋白)和 p120 联蛋白相互作用。β-联蛋白和 γ-联蛋白与 α-联蛋白结合, 并且 α-联蛋白将钙黏着蛋白-联蛋白复合体连接至肌动蛋白细胞骨架 (1,2)。β- 和 γ-联蛋白在连接复合体中发挥结构性作用,而 p120 可调节钙黏着蛋白黏附活性和转运 (1-4)。研究者认为 E-钙黏着蛋白是许多上皮癌侵润和生长的活性抑制蛋白 (1-3)。研究表明,除了上皮钙粘素丢失外,癌细胞的神经钙粘素表达上调。钙粘素表达的这种变化被称作“钙粘素转换”。N-钙黏着蛋白与 FGF 受体协作,导致 MMP-9 过表达和细胞侵袭 (3)。研究表明,在内皮细胞中,VE-钙黏着蛋白信号转导、表达和定位与血管通透性和肿瘤血管生成相关 (5,6)。研究者还已经证实,正常情况下在上皮细胞中的存在的 P-钙黏着蛋白,其表达在卵巢和其他人类癌症中也发生改变 (7,8)。
探索与本品相关的通路。
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