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47097
MLL2/KMT2B (E3M1V) Rabbit mAb (Amino-terminal Antigen)
一抗
单克隆抗体

MLL2/KMT2B (E3M1V) Rabbit mAb (Amino-terminal Antigen) #47097

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筛选器:
  1. WB
  2. IP
Western Blotting Image 1: MLL2/KMT2B (E3M1V) Rabbit mAb (Amino-terminal Antigen)

使用 MLL2/KMT2B (E3M1V) Rabbit mAb (Amino-terminal Antigen) (上图)和 α-Actinin (D6F6) XP® Rabbit mAb #6487(下图),对来自对照 293T 细胞(泳道 1)或 MLL2/KMT2B 敲除型 293T 细胞(泳道2)的提取物进行蛋白印迹分析。MLL2/KMT2B 敲除型 293T 细胞中没有信号,这证实了该抗体对 MLL2/KMT2B 的特异性。

Western Blotting Image 2: MLL2/KMT2B (E3M1V) Rabbit mAb (Amino-terminal Antigen)

使用 MLL2/KMT2B (E3M1V) Rabbit mAb (Amino-terminal Antigen) 对 NCCIT、H-4-II-E 和 COS-7 的提取物进行蛋白印迹分析。

Immunoprecipitation Image 1: MLL2/KMT2B (E3M1V) Rabbit mAb (Amino-terminal Antigen)

对来自 NCCIT 细胞提取物的 MLL2/KMT2B 蛋白进行免疫沉淀分析。泳道 1 为 10% input,泳道 2 为 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900,泳道 3 为 MLL2/KMT2B (E3M1V) Rabbit mAb (Amino-terminal Antigen)。使用 MLL2/KMT2B (E3M1V) Rabbit mAb (Amino-terminal Antigen) 进行蛋白印迹分析。Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) #5127 用作二抗。

购买 # 47097S
产品货号 规格 价格 库存
47097S
100 µl

支持数据

反应性 H M R Mk
敏感性 内源性
MW (kDa) 320
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫沉淀 1:100

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。不要分装抗体。‭

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育,并且轻轻晃动且在室温下孵育 1 小时后,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:263

天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于使用 Protein A agarose beads 对天然蛋白进行免疫沉淀,以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS,将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O 中并混合。
  2. 10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。

    注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

  3. 3X SDS上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。
  4. Protein A Agarose Beads:(#9863)。
  5. 10X 激酶缓冲液(用于激酶试验):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  6. ATP (10 mM)(用于激酶试验):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM),将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上进行 3 次超声破碎,每次 5 秒。
  6. 在 4°C,在 14,000 x g 条件下,微量离心 10 分钟,将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清(可选)

  1. 涡旋振荡,以混合磁珠。
  2. 添加 10–30 µl 的 50% Protein A agarose beads 混悬液至 200 µl 细胞裂解物中 (1 mg/ml)。
  3. 在 4°C 下,旋转孵育 30–60 分钟。
  4. 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
  5. 继续以下的免疫沉淀法。

免疫沉淀

  1. 将一抗(按产品说明书中推荐的合适稀释比例配制)加入到浓度为 1 mg/ml 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下,旋转孵育过夜。
  2. 添加 protein A 琼脂糖(10–30 µl 的 50% 珠浆)。在 4°C 下,旋转孵育 1-3 小时。
  3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活性检测对样品进行分析(D 部分)。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 对于 SDS-PAGE,将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。

注意:为了最大限度减少变性 IgG 重链产生的遮盖作用 (~50 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127

用激酶活性测定法进行分析

  1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物,并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

发布​于 2008 年 12 月 

修订于 2018 年 4 月

实验步骤编号:409

特异性/敏感性

MLL2/KMT2B (E3M1V) Rabbit mAb (Amino-terminal Antigen) 可检测 MLL2/KMT2B 总蛋白的内源水平。该抗体可检测 Taspase 1 剪切的 320kDa N 端 MLL2/KMT2B 蛋白 (MLL2/KMT2B-N) 和全长 400 kDa MLL2/KMT2B 蛋白 (MLL2/KMT2B-FL)。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴

来源/纯化

使用与人 MLL2/KMT2B 蛋白中 Ala480 周围的残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

Set1 组蛋白甲基转移酶最初是在酵母中被首次鉴定出来,并且是 Set1/COMPASS 组蛋白甲基转移酶复合体中的一部分,该复合体能使组蛋白 H3 蛋白 Lys4 位点甲基化并作为转录辅助激活因子起作用 (1)。尽管酵母仅含有一个已知的 Set1 蛋白,但哺乳类动物含有六个 Set1 相关蛋白:SET1A、SET1B、MLL1、MLL2、MLL3 和 MLL4,所有这些蛋白组装成 COMPASS 样复合体,并使组蛋白 H3 在 Lys4 位点甲基化 (2,3)。这些 Set1 相关蛋白都是在截然不同的蛋白复合体中被发现的,但它们都有共同的亚基 WDR5、RBBP5、ASH2L、CXXC1 以及 DPY30,这些亚基是复合体正确组装以及组蛋白甲基转移酶活性调节所必需的 (2-6)。MLL1 和 MLL2 复合体含有另一个蛋白亚基,menin (6)。

MLL2 也称组蛋白-赖氨酸 N-甲基转移酶 2B (KMT2B),可通过介导参与胚胎形成和血细胞生成的基因启动子处组蛋白 H3 赖氨酸 4 三甲基化来激活基因表达,并且是胚胎干细胞中二价启动子处组蛋白 H3 赖氨酸 4 三甲基化所必需的 (7)。与 MLL1一样,MLL2 是一个近似由 2,700 氨基酸的大蛋白,由 Taspase 1 苏氨酸肽链内切酶裂解来形成氨基末端 (MLL2-N) 和羧基末端 (MLL2-C) 片段,这两种片段均是功能性 MLL2/COMPASS 复合体的亚基。MLL2-N、MLL2-C、WDR5、RBBP5 和 ASH2L 明确了 MLL2/COMPASS 复合体的核心催化组分,该组分被募集至靶标基因,从而调节转录。MLL1 基因转位通常与各种血液系统恶性肿瘤有关,并且被认为是这些类型的白血病的一个驱动组分。MLL2 是记忆形成、正常葡萄糖体内平衡和小鼠胚胎干细胞心脏细胞系分化所必需的 (8-11)。一项近期研究表明,MLL2 是 MLL-AF9 转化细胞的存活所必需的,表明 MLL2 是 MLL1 重排型白血病的一种潜在调节物 (12)。MLL2 突变会导致复杂的早发性肌张力障碍,并且 MLL2 过表达与胃肠道弥漫性大 B 细胞淋巴瘤有关 (13,14)。

  1. Miller, T. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98, 12902-7.
  2. Shilatifard, A. (2008) Curr Opin Cell Biol 20, 341-8.
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  4. Lee, J.H. and Skalnik, D.G. (2005) J Biol Chem 280, 41725-31.
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  7. Denissov, S. et al. (2014) Development 141, 526-37.
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  13. Meyer, E. et al. (2017) Nat Genet 49, 223-37.
  14. Ye, H. et al. (2015) Int J Clin Exp Pathol 8, 13043-50.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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