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43110
Mitophagy Antibody Sampler Kit
一抗
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Mitophagy Antibody Sampler Kit #43110

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Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 1

使用 SQSTM1/p62 (D5E2) Rabbit mAb（上图）或 α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb #2125（下图），对转染 100 nM SignalSilence® Control siRNA (Unconjugated) #6568 (-)、SignalSilence® SQSTM1/p62 siRNA I #6394 (+) 或 SignalSilence® SQSTM1/p62 siRNA II #6399 (+) 的 HeLa 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。SQSTM1/p62 (D5E2) Rabbit mAb 确认 SQSTM1/p62 表达沉默，而 α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb 则用作上样对照。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 2

使用 SQSTM1/p62 (D5E2) Rabbit mAb #8025（上图）和 β-actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）对 HeLa 细胞（泳道 1）或 SQSTM1 敲除型细胞（泳道 2）的提取物进行蛋白印迹分析。SQSTM1 敲除型 HeLa 细胞中没有信号，这证实了抗体对 SQSTM1 的特异性。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 3

使用 NDP52 (D1E4A) Rabbit mAb 对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 4

使用 Optineurin (D2L8S) Rabbit mAb（上图）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图），对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 5

使用 Parkin (Prk8) Mouse mAb 对 PC12 细胞、胚胎大鼠和小鼠脑细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 6

使用 PINK1 (D8G3) Rabbit mAb 对转染空载 (-) 或转染表达全长人 PINK1 (hPINK1, +) 的 cDNA 表达载体的 293T 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 7

使用 BNIP3 (D7U1T) Rabbit mAb（绿色），对未经处理（左）或经氯化钴处理（100 μM，24 小时；右）的 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白丝用 DyLight™ 554 Phalliodin #13054（红色）标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 8

使用 BNIP3L/Nix (D4R4B) Rabbit mAb（绿色）对 A172 细胞（未经处理（左）或经氯化钴处理（100 μM，过夜；右））进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 9

使用 LC3B (D11) XP® Rabbit mAb #3868（实线）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（虚线）对野生型（绿色，高表达）或 LC3B 敲除型（蓝色，低表达）的 HCT-116 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。Anti-rabbit IgG (H+L)、F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 作为二抗。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 10

对经羰基氰化物 3-间氯苯腙（CCCP；30 μM，6 小时）处理的 PC-3 细胞提取物的磷酸-泛素 (Ser65) 进行免疫沉淀。泳道 1 为10% 输入，泳道 2 经 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 沉淀，而泳道 3 为 Phospho-Ubiquitin (Ser65) (E2J6T) Rabbit mAb。使用 Phospho-Ubiquitin (Ser65) (E2J6T) Rabbit mAb 进行蛋白质印迹实验。小鼠抗兔 IgG (构象特异) (L27A9) 单克隆抗体 (HRP 偶联物) #5127 用作二抗。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 11

一抗与靶标蛋白结合之后，与偶联 HRP 的二抗形成复合体。添加 LumiGLO®，在酶催化分解期间发光。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 12

使用 PINK1 (D8G3) Rabbit mAb 对未经处理 (-) 或已经 CCCP（10 μM，24 小时；+）处理的 HeLa 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 13

使用 BNIP3 (D7U1T) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人非小细胞肺癌进行免疫组织化学分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 14

使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP ® Isotype Control #3900（泳道 2）或 BNIP3L/Nix (D4R4B) Rabbit mAb（泳道3），对经氯化钴处理（100 μM，过夜）的 A172 细胞的 BNIP3L/Nix 进行免疫沉淀 。泳道 1 是 10% 输入对照。使用 BNIP3L/Nix (D4R4B) Rabbit mAb 进行蛋白质印迹分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 15

使用 LC3B (D11) XP® Rabbit mAb（绿色）对未经处理（左图）或经过 Chloroquine #14774（50 µM，过夜）（中图）处理的 HCT 116 细胞或经过 Chloroquine #14774（50 µM，过夜）（右图）处理的 LC3B HCT 116 敲除型细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白丝用 β-Actin (8H10D10) Mouse mAb（红色）标记，胞核用 DAPI #4083（蓝色）标记。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 16

使用 Phospho-Ubiquitin (Ser65) (E2J1T) Rabbit mAb（上图）、PINK1 (D8G3) Rabbit mAb #6946（中图）或 GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb #5174（下图），对未经 (-) 或已经羰基氰化物 3-间氯苯腙（CCCP；30 μM，6 小时；+）处理的 PC-3 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 17

使用 SQSTM1/p62 (D5E2) Rabbit mAb 对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 18

使用 BNIP3 (D7U1T) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人卵巢癌进行免疫组织化学分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 19

使用 BNIP3L/Nix (D4R4B) Rabbit mAb（上）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下），对未经处理 (-) 或经氯化钴处理（100 μM，过夜；+）的 A172 细胞和 HeLa 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 20

使用 LC3B (D11) XP® Rabbit mAb #3868（上图）或 GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb #5174（下图）对未经处理 (-) 或经过 Chloroquine #14774（50 μM，18 小时）处理的 HCT 116 和 HCT 116 LC3B 敲除型细胞的提取物进行蛋白印迹分析。HCT 116 敲除型细胞中没有信号，这证实了抗体对 LC3B 的特异性。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 21

对使用羰基氰化物 3-间氯苯腙（CCCP；30 μM，6 小时）处理的 PC-3 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。裂解物用 (+) 或不用 (-) Lambda 磷酸酶（λ-磷酸酶）和小牛肠磷酸酶 (CIP) 处理。使用 Phospho-Ubiquitin (Ser65) (E2J1T) Rabbit mAb（上图）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）进行蛋白质印迹实验。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 22

使用 SQSTM1/p62 (D5E2) Rabbit mAb 对未经处理的 (-) 或在 Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) 中饥饿过夜 (+) 的 SK-MEL-2 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 23

使用 BNIP3 (D7U1T) Rabbit mAb，对石蜡包埋的 MCF7 细胞沉淀物（未经处理（左）或经氯化钴处理（右））进行免疫组织化学分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 24

使用 BNIP3L/Nix (D4R4B) Rabbit mAb 对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 25

使用 LC3B (D11) XP® Rabbit mAb #3868 and α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb #2125 对用 100 nM SignalSilence® Control siRNA (Unconjugated) #6568 (-)、SignalSilence® LC3B siRNA I #6212 (+) 或 SignalSilence® LC3B siRNA II #6213 (+) 转染的 HeLa 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。LC3B (D11) XP® Rabbit mAb 可确认 LC3B 的表达沉默，而 α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb 则用于 LC3B siRNA 的上样和特异性对照。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 26

使用 SQSTM1/p62 (D5E2) Rabbit mAb 对转染空载 (-) 或转染带标记的人 SQSTM1/p62 表达载体 (+) 的 293T 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 27

在对照肽（左）和抗原特异性肽（右）存在下，使用 BNIP3 (D7U1T) Rabbit mAb 对石蜡包埋的正常人肝进行免疫组织化学分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 28

使用 BNIP3L/Nix (D4R4B) Rabbit mAb，对转染空载（-）或转染带有 DYKDDDDK 标签的全长人 BNIP3L/Nix（hBNIP3L/Nix-DYKDDDDK；+）表达载体的 293T 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。BNIP3L/Nix 构建体由 Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA 的 Reuben Shaw 博士惠赠。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 29

对氯化钴处理（100 μM；过夜）的 MCF7细胞 BNIP3 进行免疫沉淀 。泳道 1 为 10% input，泳道 2 为 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900，泳道 3 为 BNIP3 (D7U1T) Rabbit mAb。使用 BNIP3 (D7U1T) Rabbit mAb 进行蛋白质印迹分析。构象特异性二抗用来避免与 IgG 的反应性。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 30

使用 BNIP3 (D7U1T) Rabbit mAb（上）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下），对未经处理 (-) 或经氯化钴处理（100 μM，过夜；+）的 HeLa 细胞或 MCF7 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

Mitophagy Antibody Sampler Kit: Image 31

使用 BNIP3 (D7U1T) Rabbit mAb，对转染空载（-）或转染带有 Myc 标签的全长人 BNIP3 蛋白（hBNIP3-Myc；+））表达载体的 293T 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。

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特异性/敏感性

Mitophagy Antibody Sampler kit 中的每种抗体均可检测内源水平的靶标蛋白。LC3B (D11) XP® Rabbit mAb 可检测 I 型和 II 型 LC3B。观察到与啮齿动物 LC3B 有较弱的反应性。

来源/纯化

使用与人 SQSTM1/p62 的 Gly162、人 NDP52 的 Val135、人 PINK1 的 Pro140、人视神经蛋白的 Leu410、人 BNIP3L/Nix 的 Glu128 周围的残基相对应的合成肽、与人 LC3B 的氨基末端、人 BNIP3 的氨基末端周围的残基相对应的肽序列、表位比对至人 Parkin 中羧基末端的重组融合蛋白、与人泛素蛋白中 Ser65 周围的残基相对应的合成磷酸肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。使用蛋白质 A 和肽亲和色谱对抗体进行纯化。

背景

自噬是自噬体-溶酶体降解大量胞质内容物的分解代谢过程 (1, 2)。选择性自噬会靶向不同组的底物和细胞器发生降解 (3-5)。选择性自噬的其中一个最佳研究示例涉及通过一个称为线粒体自噬的过程清除受损线粒体。对于不同线粒体自噬环境，现已发现多种通路，包括 FUNDC1 通路、BNIP3 和 BNIP3L/Nix 通路以及 PINK1/Parkin 通路。FUNDC1 是一种被自噬激酶 ULK1 磷酸化的线粒体蛋白，可调节缺氧诱导的线粒体自噬 (6, 7)。BNIP3L/Nix 和 BNIP3 是凋亡调节分子 Bcl-2 家族的成员，它们在线粒体中表达，会被缺氧诱导，并且经证实在线粒体自噬中发挥作用 (8)。BNIP3L/Nix 在红系细胞的自噬成熟中也很重要 (9)。FUNDC1、BNIP3 和 BNIP3L/Nix 结合 LC3 家族成员，以靶向线粒体到自噬体。

非缺氧诱导的线粒体自噬通过 PINK1/Parkin 通路进行调节，该通路在神经退行性疾病中发挥诱因作用，这在帕金森病中尤为突出 (10, 11)。PINK1 是一种线粒体丝氨酸/苏氨酸激酶，在受损线粒体的线粒体外膜上很稳定。PINK1 底物包括 E3 泛素连接酶 Parkin 和泛素本身 (12-14)。Parkin 磷酸化和结合磷酸化泛素会导致泛素化链聚集在多个线粒体蛋白上。泛素化蛋白通过 SQSTM1/p62、视神经蛋白和 NDP52 等选择性转运受体进行识别 (15-16)。自噬转运受体包含一个 LC3 互作区域 (LIR)，LIR 是结合 Atg8/LC3 家族成员并靶向到自噬体所必需的 (3)。

Mitophagy Antibody Sampler Kit 是一种经济合算的方法，可用来检测参与线粒体自噬过程的蛋白。该试剂盒含有足量的一抗，每种一抗可进行 2 次蛋白质印迹实验。

  1. Reggiori, F. and Klionsky, D.J. (2002) Eukaryot. Cell 1, 11-21.
  2. Codogno, P. and Meijer, A.J. (2005) Cell Death Differ. 12 Suppl 2, 1509-18.
  3. Birgisdottir, Å.B. et al. (2013) J Cell Sci 126, 3237-47.
  4. Xu, Z. et al. (2015) Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 47, 571-80.
  5. Mancias, J.D. and Kimmelman, A.C. (2016) J Mol Biol 428, 1659-80.
  6. Liu, L. et al. (2012) Nat Cell Biol 14, 177-85.
  7. Wu, W. et al. (2014) EMBO Rep 15, 566-75.
  8. Sowter, H.M. et al. (2001) Cancer Res 61, 6669-73.
  9. Sandoval, H. et al. (2008) Nature 454, 232-5.
  10. Kitada, T. et al. (1998) Nature 392, 605-8.
  11. Valente, E.M. et al. (2004) Science 304, 1158-60.
  12. Kim, Y. et al. (2008) Biochem Biophys Res Commun 377, 975-80.
  13. Kane, L.A. et al. (2014) J Cell Biol 205, 143-53.
  14. Koyano, F. et al. (2014) Nature 510, 162-6.
  15. Heo, J.M. et al. (2015) Mol Cell 60, 7-20.
  16. Lazarou, M. et al. (2015) Nature 524, 309-314.

通路和蛋白

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