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92511
Human CD3ε Activating (OKT3) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free)
一抗
单克隆抗体

Human CD3ε Activating (OKT3) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) #92511

引用 (0)
Human CD3ε Activating (OKT3) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free): Image 1
使用 Phospho-SLP-76 (Ser376) (E3G9U) XP® Rabbit mAb #76384(实线)或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900(虚线)对未经处理(蓝色)或经过交联的 CD3ε Activating (OKT3) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) 和 Human CD28 Activating (CD28.2) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) #91920(各为 10 μg/ml,15 分钟;绿色)的 Jurkat 细胞进行流失细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L)、F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 作为二抗。
Human CD3ε Activating (OKT3) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free): Image 2
使用 Phospho-SLP-76 (Ser376) (D7S1K) Rabbit mAb #92711(上图)、SLP-76 (E4N7E) Rabbit mAb #25361(中图)和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图)对未经处理 (1) 或经过交联的 Human CD3ε Activating (OKT3) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) 和 Human CD28 Activating (CD28.2) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) #91920(10 μg/ml,30 分钟)(2) 处理的 Jurkat 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
To Purchase # 92511S
产品货号 规格 价格 库存
92511S
100 µg

支持数据

反应性
敏感性 内源性
MW (kDa)
来源/亚型 Mouse IgG2a kappa

应用缩写:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品说明

内毒素 小于或等于 0.01 EU/μg,通过 LaL 测定来确定。

保存

保存在 10 mM NaH2PO4、150 mM NaCl(pH 为 7.2)中。保存在 4°C 时,可保持稳定 12 个月。不要分装抗体。‭

实验步骤

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A. 溶液和试剂

  1. Human CD3ε Activating (OKT3) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) #92511
  2. Human CD28 Activating (CD28.2) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) #91920
  3. 仅用于可溶性刺激:Goat Anti-Mouse Kappa Light Chain, F(ab’)2 Antibody (Low Endotoxin, Azide-free) #75861

B. 刺激实验步骤:可溶性

  1. 通过离心分离采集目标细胞。
  2. 抽吸上清液。
  3. 使用冷无血清培养基,以 106-107 个细胞/ml 重悬细胞。
  4. 以 1:200 的比例把 CD3ε Activating (OKT3) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) #92511 添加到细胞中,以达到 10 µg/ml 的最终浓度。
  5. 可选:以 1:200 的比例把 Human CD28 Activating (CD28.2) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) #91920 添加到细胞中,以达到 10 µg/ml 的最终浓度。
  6. 将带激动剂抗体的细胞置于冰上 30 分钟。
  7. 通过离心收集细胞。
  8. 抽吸上清液。
  9. 使用无血清冷培养基,以 106-107 个细胞/ml 重悬细胞,并置于冰上。
  10. 如果仅使用 CD3ε (OKT3) ,则以 1:50 的比例把 Goat Anti-Mouse Kappa Light Chain, F(ab’)2 Antibody (Low Endotoxin, Azide-free) #75861 二抗添加到细胞中,以达到 10 µg/ml 的最终浓度;如果同时使用 CD3ε (OKT3) 和 CD28 (CD28.2),则以 1:25 的比例添加以达到 20 µg/ml 的最终浓度。
  11. 将含二抗的细胞置于冰上 15 分钟。
  12. 要启动刺激,将细胞转移到 37 °C 水浴维持刺激所需的时间。
  13. 要终止刺激,请遵循为所需分析方法推荐的细胞制备实验步骤。

C. 刺激实验步骤:基于板子

  1. 在无菌 10 PBS 中制备 µg/ml 的 CD3ε Activating (OKT3) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) 92511# 溶液。准备足够的体积以覆盖孔底部,用于刺激 T 细胞(96 孔板大约为 50 µl,6 孔板为 1 ml)。
  2. 将稀释的 CD3ε (OKT3) 抗体溶液添加到选择作为处理组的孔中。将等量的无菌 PBS 添加到选择作为处理对照的孔中。
  3. 盖上反应板并在 37 °C 下孵育至少 2 小时。如果需要,可以让反应板温育过夜。
  4. 根据需要制备细胞,以在足够体积的完整培养基中生成大约 1 x 106 细胞/ml 的细胞悬液(对于 96 孔板,每孔 100 µl;{ut6 } ml 用于 6 孔板)。最佳细胞密度可以使用待研究的细胞进行预实验来确定。对于 T 细胞扩增,向细胞悬液中加入 Human Interleukin-2 (hIL-2) #8907 以产生 20 ng/ml 的最终浓度。
  5. 从孔中吸出 CD3ε (OKT3) 抗体溶液,并用多余的无菌 PBS 冲洗孔 2 次,以去除未结合的抗体。
  6. 按步骤 4 中指定的体积或通过实验确定的体积,将细胞悬浮液添加到所有孔中。
  7. 添加 Human CD28 Activating (CD28.2) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) #91920 以产生 2 µg/ml 的最终浓度。如果需要,在完全培养基中预稀释 CD28 (CD28.2) 抗体。如果需要,也可以将 CD28 抗体添加到部分对照孔中。
  8. 在加湿培养箱中培养细胞所需的时间(37 °C,5% CO2)。根据需要添加含有 IL-2 的新鲜培养基以进行 T 细胞扩增。
  9. 收集细胞,然后根据需要进行免疫染色或分析。

实验步骤编号:2450

特异性/敏感性

Human CD3ε Activating (OKT3) Mouse mAb (Low Endotoxin, Azide-free) 可识别 CD3ε 蛋白的内源水平。

来源/纯化

单克隆抗体是针对人 PBMC 细胞产生的,并通过亲和层析进行纯化。

背景

当 T 细胞经 T 细胞受体 (TCR) 遭遇抗原时,抗原数量和性质信息将中继至胞内信号转导装置 (1)。该激活过程主要取决于直接与 TCR 结合的多亚基蛋白质复合体 CD3(分化抗原簇 3)。CD3 主要由四种多肽组成:ζ、γ、ε 和 δ。每一个多肽包含至少一个免疫受体基于酪氨酸激活域 (ITAM) 的区域 (2)。TCR 复合体与外来抗原的接合在 ITAM 基序中诱导酪氨酸磷酸化,并且磷酸化的 ITAM 作为信号转导分子(如 ZAP-70 和 PI-3 激酶的 p85 亚基)的对接位点发挥作用 (3,4)。TCR 连接还在 CD3ε 中诱导构象变化,从而导致脯氨酸区暴露,并且随后与接头蛋白 Nck 结合 (5)。
  1. Kuhns, M.S. et al. (2006) Immunity 24, 133-139.
  2. Pitcher, L.A. and van Oers, N.S. (2003) Trends Immunol. 24, 554-560.
  3. Osman, N. et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26, 1063-1068.
  4. Hatada, M.H. et al. (1995) Nature 377, 32-38.
  5. Gil, D. et al. (2002) Cell 109, 901-912.

通路和蛋白

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