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2595
Histone H2A.X Antibody
一抗
多克隆抗体

Histone H2A.X Antibody #2595

引用 (102)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1 - Histone H2A.X Antibody

使用 Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody #2577(上)或 Histone H2A.X Antibody(下),对细胞提取物进行蛋白质印迹分析,而细胞为未处理 (-) 或使用紫外线(50 mJ 处理 2 小时)或用铬酸钠 (6 uM 处理 2 或 24 小时) 进行处理 293 。

购买 # 2595S
产品货号 规格 价格 库存
2595S
100 µl

支持数据

反应性 H M R Mk
敏感性 内源性
MW (kDa) 15
来源

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10mM sodium HEPES(pH 为 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

特异性/敏感性

Histone H2A.X Antibody 可检测组蛋白 H2A.X 蛋白的内源水平,不依赖于磷酸化和泛素化。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴

来源/纯化

使用与人组蛋白 H2A.X 羧基末端附近残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。使用蛋白质 A 和肽亲和色谱对抗体进行纯化。

背景

组蛋白 H2A.X 是一种组蛋白变体,约占正常人成纤维细胞中总 H2A 组蛋白的 10% (1)。H2A.X 对检查点介导的细胞周期停滞、DNA 双链断裂后的 DNA 修复必不可少 (1)。电离辐射、紫外线灯或拟辐射剂所致 DNA 损伤,可导致 H2A.X 在 Ser139 位点被 PI3K 样激酶(包括 ATM、ATR 和 DNA-PK )快速磷酸化(2,3)。DNA 损伤后几分钟内,在 DNA 损伤位置的H2A.X Ser139 位点发生磷酸化 (4)。在 DNA 损伤反应中的这一极早期事件中,募集大量 DNA 损伤反应蛋白必不可少,其中包括有 MDC1、NBS1、RAD50、MRE11、53BP1 和 BRCA1 (1)。除了在 DNA 损伤修复中发挥作用外,H2A.X 对凋亡过程中 DNA 碎裂也不可或缺,并且在对凋亡信号作出响应时,会由不同的激酶磷酸化。在细胞死亡受体激活时,H2A.X  由 DNA-PK 在 Ser139 位点磷酸化,在长波紫外线作用下,由 c-Jun 氨基末端激酶 (JNK1) 在 Ser139 位点磷酸化,在血清饥饿时,由 p38 MAPK 在 Ser139 位点磷酸化 (5-8)。H2A.X 在未损伤细胞中由 WSTF 在 Tyr142 位点持续磷酸化(Williams-Beuren 综合征转录因子)(9,10)。在 DNA 损伤基础上,同时发生 Ser139 磷酸化,Tyr142 通过募集 EYA1 和 EYA3 磷酸酶在 DNA 损伤位点发生去磷酸化 (9)。虽然 Ser139 位点的磷酸化促进 DNA 修复蛋白和凋亡蛋白募集到 DNA 损伤位点,但 Tyr142 位点的磷酸化似乎可决定募集哪些蛋白。H2A.X 在 Tyr142 位点的磷酸化抑制 DNA 修复蛋白的募集,促进促凋亡因子如 JNK1 的结合 (9)。小鼠胚胎成纤维细胞只表达 H2A.X Y142F 突变体,此突变体倾向于 DNA 修复蛋白的募集胜过凋亡蛋白,表现出对电离辐射的凋亡反应减少 (9)。因此,H2A.X 在 Tyr142 的磷酸化和去磷酸化平衡,是 DNA 损伤后的细胞转归的转换机制。

  1. Yuan, J. et al. (2010) FEBS Lett 584, 3717-24.
  2. Rogakou, E.P. et al. (1998) J Biol Chem 273, 5858-68.
  3. Burma, S. et al. (2001) J Biol Chem 276, 42462-7.
  4. Rogakou, E.P. et al. (1999) J Cell Biol 146, 905-16.
  5. Mukherjee, B. et al. (2006) DNA Repair (Amst) 5, 575-90.
  6. Solier, S. et al. (2009) Mol Cell Biol 29, 68-82.
  7. Lu, C. et al. (2006) Mol Cell 23, 121-32.
  8. Lu, C. et al. (2008) FEBS Lett 582, 2703-8.
  9. Cook, P.J. et al. (2009) Nature 458, 591-6.
  10. Xiao, A. et al. (2009) Nature 457, 57-62.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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