Cat. # | Size | Price | Inventory |
---|---|---|---|
81493S | 100 µl |
REACTIVITY | H |
SENSITIVITY | Endogenous |
MW (kDa) | 75, 85 |
Source/Isotype | Rabbit IgG |
Product Information
For optimal ChIP results, use 10 μl of antibody and 10 μg of chromatin (approximately 4 x 106 cells) per IP. This antibody has been validated using SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kits.
The CUT&RUN dilution was determined using CUT&RUN Assay Kit #86652.
Application | Dilution |
---|---|
Western Blotting | 1:1000 |
Immunofluorescence (Immunocytochemistry) | 1:400 - 1:1600 |
Flow Cytometry (Fixed/Permeabilized) | 1:400 - 1:1600 |
Chromatin IP | 1:50 |
CUT&RUN | 1:50 |
For western blots, incubate membrane with diluted primary antibody in 5% w/v BSA, 1X TBS, 0.1% Tween® 20 at 4°C with gentle shaking, overnight.
NOTE: Please refer to primary antibody product webpage for recommended antibody dilution.
From sample preparation to detection, the reagents you need for your Western Blot are now in one convenient kit: #12957 Western Blotting Application Solutions Kit
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
Load 20 µl onto SDS-PAGE gel (10 cm x 10 cm).
NOTE: Loading of prestained molecular weight markers (#59329, 10 µl/lane) to verify electrotransfer and biotinylated protein ladder (#7727, 10 µl/lane) to determine molecular weights are recommended.
NOTE: Volumes are for 10 cm x 10 cm (100 cm2) of membrane; for different sized membranes, adjust volumes accordingly.
* Avoid repeated exposure to skin.
posted June 2005
revised June 2020
Protocol Id: 10
Achieve higher quality immunofluorescent images using the efficient and cost-effective, pre-made reagents in our #12727 Immunofluorescence Application Solutions Kit
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
Recommended Fluorochrome-conjugated Anti-Rabbit secondary antibodies:
NOTE: Cells should be grown, treated, fixed and stained directly in multi-well plates, chamber slides or on coverslips.
Aspirate liquid, then cover cells to a depth of 2–3 mm with 4% formaldehyde diluted in 1X PBS.
NOTE: Formaldehyde is toxic, use only in a fume hood.
NOTE: All subsequent incubations should be carried out at room temperature unless otherwise noted in a humid light-tight box or covered dish/plate to prevent drying and fluorochrome fading.
posted November 2006
revised November 2013
Protocol Id: 24
All reagents required for this protocol may be efficiently purchased together in our Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593, or individually using the catalog numbers listed below.
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
NOTE: When including fluorescent cellular dyes in your experiment (including viability dyes, DNA dyes, etc.), please refer to the dye product page for the recommended protocol. Visit www.cellsignal.com for a full listing of cellular dyes validated for use in flow cytometry.
NOTE: Adherent cells or tissue should be dissociated and in single-cell suspension prior to fixation.
NOTE: Optimal centrifugation conditions will vary depending upon cell type and reagent volume. Generally, 150-300g for 1-5 minutes will be sufficient to pellet the cells.
NOTE: If using whole blood, lyse red blood cells and wash by centrifugation prior to fixation.
NOTE: Antibodies targeting CD markers or other extracellular proteins may be added prior to fixation if the epitope is disrupted by formaldehyde and/or methanol. The antibodies will remain bound to the target of interest during the fixation and permeabilization process. However, note that some fluorophores (including PE and APC) are damaged by methanol and thus should not be added prior to permeabilization. Conduct a small-scale experiment if you are unsure.
NOTE: Count cells using a hemocytometer or alternative method.
posted July 2009
revised June 2020
实验步骤编号:404
针对以下产品:SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383。
包括的试剂:
未包括的试剂:
! | 这就表示在实验流程中基于免疫沉淀制备物(IP 制备物)数量的容积改变是重要的一步。一份 IP 制备物是指 4 x 106 个组织培养细胞或 25 mg 离体的组织。 |
!! | 这就表示,进行操作前稀释缓冲液是重要的一步。 |
安全停止 | 如果需要停止,这是实验步骤中的一个安全停止点。 |
收获组织时,去除样品中不需要的物质,如脂肪和坏死物质。组织可以立即处理和交联,或放在干冰上冷冻供后续处理。为获得最佳 ChIP 结果,每次免疫沉淀使用 25 mg 组织。应额外处理 5 mg 组织用于“分析染色质消化和浓度”,并用作输入染色质(第四部分)。不同组织类型的染色质产率不尽相同,每次免疫沉淀时,某些组织可能需要超过 25 mg。
一次染色质制备量规定为 100 至 150 mg 组织。对于某些组织类型,这种建议的组织量可能会导致低产率,但在超声处理过程中可确保高效的染色质碎裂。有关不同组织类型的预期染色质产率的更多信息,请参见附录 A。
在开始之前:
(!) 所有缓冲液体积应根据实验中染色质制备物的数量按比例添加。
为获得最佳 ChIP 结果,每次免疫沉淀使用大约 4 x 106 个细胞。对于 HCT 116 细胞,这相当于 15 cm 培养皿所含细胞(在 20 ml 生长培养基中的融合度为 90%)的 1/3。应额外处理 1 x 106 个细胞用于“分析染色质消化和浓度”,并用作输入染色质(第四部分)。
一次染色质制备量规定为 1 x 107 至 2 x 107 个细胞。对于某些细胞类型,这种建议的细胞量可能会导致低产率,但在超声处理过程中可确保高效的染色质碎裂。
在开始之前:
(!) 所有缓冲液体积应根据实验中使用的 15 cm 组织培养皿(或 20 ml 悬浮细胞)的数量按比例增加。
一次染色质制备量规定为 100-150 mg 组织或 1 x 107-2 x 107 个组织培养细胞。可以同时进行多份染色质制备,只要相应增加缓冲液用量并对 1 ml 样品进行超声处理。超声处理所使用的细胞数量和样品量对于产生合适大小的染色质片段非常关键。
在开始之前:
(!) 所有缓冲液体积应根据实验中染色质制备物的数量按比例添加。
为获得最佳 ChIP 结果,每次免疫沉淀使用大约 5-10 μg 经超声处理的交联染色质(第 四 部分中确定的量)。这应大致相当于用 25 mg 离散组织或 4x106 个组织培养细胞制备的一份 100 µl 免疫沉淀制备物。在添加抗体之前,通常将 100μl 消化的染色质稀释到 400μl 1X ChIP 缓冲液中。但如果每次免疫沉淀需要多于 100 µl 的染色质,则必须将交联染色质制备物按 1:4 的稀释比例在 1X ChIP 缓冲液中稀释。在这种情况下,无需添加 蛋白 G 磁珠,尽管延长用微珠孵育的时间比较有用。
在开始之前:
(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。
注意:对于 Cell Signaling Technology 的多数抗体,每份免疫沉淀样品使用 1-2 µg 时的效果最佳。如有多份不同浓度的样品,最好让阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。
在开始之前:
(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。
在开始之前:
建议:
引物长度: | 24 个核苷酸 |
最佳 Tm: | 60℃ |
最佳 GC: | 50% |
扩增子尺寸: | 150 至 200 bp(标准 PCR) |
80 至 160 bp(实时荧光定量 PCR) |
标准 PCR 方法:
试剂 | 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl) |
---|---|
无核酸酶的 H2O | 12.5 μl |
10X PCR 缓冲液 | 2.0 μl |
4mM dNTP 混合物 | 1.0 μl |
5 μM RPL30 引物 | 2.0 μl |
Taq DNA 聚合酶 | 0.5 μl |
实时荧光定量 PCR 方法:
试剂 | 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl) |
---|---|
无核酸酶的 H2O | 6 μl |
5 μM RPL30 引物 | 2 μl |
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 | 10 μl |
a. | 初始变性 | 95℃ 3 分钟 |
b. | 变性 | 95℃ 15 秒 |
c. | 复性和延伸: | 60℃ 60 秒 |
d. | 重复步骤 b 和 c,共循环 40 次。 |
输入百分比 = 2% x 2(C[T] 2% 输入样品 - C[T] 免疫沉淀样品)
C[T] = CT = PCR 反应的平均循环阈值
用这种试剂盒制备的免疫富集的 DNA 样品可用于 ChIP-seq 。要构建下游 NG 测序用 DNA 文库,请使用与您的下游测序平台相容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。对于 Illumina® 平台上测序,我们建议使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 及其相关索引引物 Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538。
建议:
从组织样品收获交联的染色质时,组织类型之间的染色质产率可能显著不同。右表提供用 100 mg 组织与 2 x 107 个 HCT 116 细胞制备的染色质的预期产量范围,以及实验步骤第 四 部分确定的预期 DNA 浓度。为了获得最佳 ChIP 结果,我们建议使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 及其相关索引引物 Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538。
组织/细胞 | 染色质总产率 | 预期 DNA 浓度 |
---|---|---|
肝 | 每 100 mg 组织使用 50 µg | 150 µg/ml |
脑 | 每 100 mg 组织使用 25 µg | 50 µg/ml |
心脏 | 每 100 mg 组织使用 105 µg | 20 µg/ml |
HCT 116 | 100-150 μg/2 x 107 个细胞 | 100-150 μg/ml |
转录因子和辅因子结合染色质 DNA 没有结合组蛋白紧密。因此,它们在超声处理期间容易脱离染色质。在 ChIP 实验中,延长固定时间能捕获更多转录因子和辅因子,尤其是使用组织样品时。如图 7 所示,固定时间从 10 分钟延长至 30 分钟可能会减小染色质片段(左小图),但 ChIP-qPCR 表明,这会显著增加心脏组织中辅因子 RING1B 和 SUZ12 的富集(中间小图和右小图)。
通常,对于同时使用细胞和组织样品的组蛋白修饰 ChIP,10 分钟固定即可,而转录因子和辅因子可能需要长达 30 分钟的额外固定时间,尤其是使用组织样品时。
图 7. 使小鼠心脏 (H)、脑 (B) 和肝 (L) 细胞交联 10 分钟或 30 分钟,如图所示(左小图)。染色质制备后进行声处理,对 DNA 进行纯化并用 1% 琼脂糖凝胶进行电泳来分离。在 ChIP-qPCR 检测(中间和右小图)中,使用 RING1B (D22F2) XP® 兔单克隆抗体 #5694 或 SUZ12 (D39F6) XP® 兔单克隆抗体 #3737 进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® Mouse HoxD10 Exon 1 Primers #7429、SimpleChIP® Mouse HoxA1 Promoter Primers #7341 和 SimpleChIP® Mouse GAPDH Intron 2 Primers #8986,通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每份样品中免疫沉淀 DNA 的数量表示为向阴性 GAPDH 基因座发出的标准化信号(等于 1)。
交联染色质 DNA 碎裂的最佳条件高度依赖于使用的细胞数量、样品体积、超声处理时长和超声波仪功率设置。对于每份经声处理的样品,我们建议每 1 ml ChIP 声处理胞核裂解缓冲液用 100-150 mg 组织或 1 x 107-2 x 107 个细胞。 以下是确定某种特定组织或细胞类型的最佳超声处理条件的实验步骤。
注意:使用不同样品类型和固定时间时,最佳超声处理条件也不同。使用产生所需长度染色质片段需要的最少超声处理循环次数。超过 80% 短于 500 bp 的总 DNA 片段表明,过分超声处理会导致染色质过度受损,并会降低免疫沉淀效率(见图 8,右小图)
图 8. 将 HCT 116 细胞交联 10 分钟,并对其进行规定时间的声处理(左小图)。DNA 按照 SimpleChIP® Plus 超声法染色体免疫共沉淀试剂盒 #56383 的第四部分的说明进行纯化,并用 1% 琼脂糖凝胶进行电泳来分离出 20 µl 纯化的 DNA。如左小图所示,增加超声处理循环次数会减小染色质片段的大小。使用 SimpleChIP® Plus 超声法染色体免疫共沉淀试剂盒 #56383 对非磷酸化(活性)β-连环蛋白 (Ser33/37/Thr41) (D13A1) 兔单克隆抗体 #8814、TCF4/TCF7L2 (C48H11) 兔单克隆抗体 #2569 或正常兔 IgG #2729 进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® Human CaMK2D Intron 3 Primers #5111 和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486,通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每份样品中免疫沉淀的 DNA 数量表示为与输入染色质总量相对应的信号(等于 100%;右小图)。如图所示,使用配有 1/8 英寸微探头的 Branson Digital Sonifier D250 探头超声波仪时,4 分钟的染色质声处理最佳。过度超声处理会明显有损辅因子 β-catenin 和包含染色质的转录因子 TCF4/TCF7L2 的富集。
问题 | 可能的原因 | 建议 |
---|---|---|
1. 碎裂染色质的浓度过低。 |
细胞/细胞核裂解不完全。 染色质制备没有使用足够细胞。 |
如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml,则向每次 IP 中添加额外的染色质以确保每次 IP 至少产生 5 μg,然后继续实验。 交联前,对单独平板上的细胞进行计数,以确定准确的细胞数量。 |
2. 染色质碎裂不足,且片段过大(超过 50% 的片段大于 1.5 kb)。 |
细胞可能已经过度交联。 处理了过多细胞/组织。 |
将交联时间缩短到 10-30 分钟的范围。减少每次超声处理的细胞/组织数量。进行超声处理时程。 |
3. 染色质过度碎裂(超过 90% 的片段小于 300 bp)。 |
超声处理条件太苛刻。 |
进行一次超声处理时程来找到进行相应超声处理的最小输出/时长。 |
4. 样品输入对照组 PCR 反应中无产物或产物很少。 |
添加至 PCR 反应的 DNA 不足或条件不是最佳。 PCR 扩增区域可能跨越无核小体的区域。 加入到免疫沉淀的染色质不足,或染色质被过度超声处理。 |
向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。 使用从交联并经超声处理的染色质中获得的纯化 DNA 来优化针对实验用引物组的 PCR 条件。为获得最佳 ChIP 结果,每次 IP 添加 5-10 μg 染色质。参见上述问题 1 和 3 的建议。 |
5. 阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中无产物。 |
添加至 IP 反应的染色质或抗体不足,或者 IP 孵育时间过短。 蛋白 G 微珠中染色质洗脱不完全。 |
确保每次免疫沉淀反应添加 5-10 µg 染色质和 10 µl 抗体,并用抗体孵育过夜,添加蛋白 G 微珠之后再孵育 2 小时。 在 65℃ 下将染色质从蛋白 G 微珠洗脱为最佳,同时频繁混合以保持微珠悬浮在溶液中。 |
6. 阴性对照 Rabbit IgG-IP 和阳性对照 Histone H3-IP PCR 反应中产物的数量相等。 |
添加至 IP 反应的染色质过多或不足。或者,添加至 IP 反应的抗体过多。 添加至 PCR 反应的 DNA 过多或扩增循环次数过多。 |
向每次 IP 反应中添加不超过 15 μg 的染色质和 10 μl Histone H3 Antibody。每次 IP 将 Normal Rabbit IgG 缩减至1 µl/IP。 向 PCR 反应中添加更少的 DNA 或减少 PCR 循环次数。在 PCR 的线性扩增阶段范围内分析 PCR 产物极为重要。否则,起始 DNA 数量的差异无法准确测量。 |
7. 实验抗体 IP PCR 反应中无产物。 |
添加至 PCR 反应的 DNA 不足。 添加至 IP 反应的抗体不足。 抗体不适用于 IP。 |
向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。 通常,免疫沉淀反应需添加 1-5 µg 抗体;但准确的用量在很大程度上取决于具体抗体。 增加添加至 IP 反应的抗体量。寻找其他替代抗体。 |
发布时间 2017 年 3 月
修订时间 2022 年 4 月
实验步骤编号:1384
! | ! 表示实验步骤中需要根据进行的 CUT&RUN 反应次数来调整体积的重要步骤。 |
!! | !! 表示需要在操作前稀释缓冲液的一个重要步骤。 |
安全停止 | 如果需要停止,这是实验步骤中的一个安全停止点。 |
对于大多数细胞类型,活细胞可用于 CUT&RUN 检测,以产生强大的组蛋白、转录因子和辅因子富集。就某些对伴刀豆球蛋白 A 脆弱或敏感的细胞类型,略微固定细胞有助于保存细胞并保持它们完整。此外,如果使用新鲜细胞未观察到明显信号,固定可能有助于促进低丰度和/或弱结合转录因子和辅因子的富集。请注意,细胞的过度固定会抑制 CUT&RUN 检测。
我们的 CUT&RUN 分析适用于广泛的细胞或组织。如实验步骤中定义,一个 CUT&RUN 反应可包含 5,000 至 个 250,000 细胞或 1 至 5 mg 的组织。整个实验步骤中使用的缓冲液体积无需根据每次反应的细胞或组织数量进行调整,只要在此范围内即可。当需要时,缓冲液体积确实需要根据正在执行的反应数量按比例增加。如果可能,我们建议每次反应使用 100,000 个细胞或 1 mg 组织。如果细胞数量有限,我们建议每个反应至少使用 5,000 到 10,000 个细胞进行组蛋白修饰,每个反应至少使用 10,000 到 20,000 个细胞进行转录因子或辅因子。
注意: 推荐用于细胞透化的毛地黄皂苷的量是过量的,应该足以用于大多数细胞系和组织类型的通透。然而,并非所有细胞系和组织对毛地黄皂苷都表现出相同的敏感性。如果您的特定细胞系或组织在推荐的毛地黄皂苷浓度下不起作用,您可以按照附录 A 中提供的实验步骤来优化条件。毛地黄皂苷处理应导致 >90% 的细胞群通透。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注意: 应在室温下连续进行活细胞(无固定)制备步骤,以尽量减少对细胞的压力。为了尽量减少 DNA 碎片,在重悬过程中避免剧烈涡旋和样品起泡。为 CUT&RUN 制备活细胞时,我们建议在制备细胞之前准备伴刀豆球蛋白 A 珠子(第 II 部分,步骤 1 到 5),以尽量减少细胞在珠子制备过程中停留的时间。活化的珠子可以储存在冰上直到准备使用。
注:对于贴壁细胞,首先需要使用胰蛋白酶将细胞从培养皿中分离出来,并用至少 3 体积的组织培养基中和。我们不建议从培养皿中刮取细胞,因为这会压迫甚至裂解细胞。应使用血细胞计数器或其他细胞计数器对细胞进行计数,以确保用于实验的细胞数量正确。
注:处理低细胞数(<100,000 总细胞)的挑战在于,离心后的细胞颗粒并不总是肉眼可见,因此很容易在洗涤步骤中丢失细胞。因此,当处理低细胞数时,我们建议跳过下面的洗涤步骤 3 到 5。伴刀豆球蛋白 A 珠与细胞的结合耐受结合反应中有 40% 的细胞培养基。因此,在步骤 2 中对细胞悬浮液进行初始离心后,可以去除大部分上清液,每次反应留下 ≤40 µl 细胞培养基。然后在步骤 6 中,向细胞悬液中加入足够的 1X 洗涤缓冲液(+ 亚精胺 + PIC),使每次反应的总体积达到 100 µl。
注意:在随后的实验步骤中,将在 55°C 下孵育 input 样品,因此建议使用一根可封盖的 1.5 ml 试管,以减少孵育过程出现蒸发。
注:固定细胞制备需要以下试剂,不包含在此试剂盒中:37% 甲醛或 16% 无甲醇的甲醛 #12606,甘氨酸溶液 (10X) #7005 和 10% SDS 溶液 #20533。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注释:对于贴壁细胞系,首先需要使用胰蛋白酶将细胞从培养皿中分离出来,并用至少 3 体积的培养基中和。我们不建议从培养皿中刮取细胞,因为这会压迫甚至裂解细胞。应使用血细胞计数器或其他细胞计数器对细胞进行计数,以确保用于实验的细胞数量正确。
注:处理低细胞数(<100,000 总细胞)的挑战在于,离心后的细胞颗粒并不总是肉眼可见,因此很容易在洗涤步骤中丢失细胞。在这种情况下,我们不建议冷冻细胞沉淀物。此外,当处理这些低细胞数时,我们建议跳过下面的洗涤步骤 5 到 7。伴刀豆球蛋白 A 珠与细胞的结合耐受结合反应中有 40% 的细胞培养基。因此,在步骤 4 中对细胞悬浮液进行初始离心后,可以去除大部分上清液,每次反应留下 ≤40 µl 细胞培养基。然后在步骤 8 中,向细胞悬液中加入足够的 1X 洗涤缓冲液(+ 亚精胺 + PIC),使每次反应的总体积达到 100 µl。
注意:在随后的实验步骤中,将在 55°C 下孵育 input 样品,因此建议使用一根可封盖的 1.5 ml 试管,以减少孵育过程出现蒸发。
对于大多数组织类型,1 mg 轻微固定的组织(0.1% 甲醛,2 分钟)可以产生强大的组蛋白、转录因子和辅因子富集。富集组蛋白修饰不需要甲醛固定。然而,许多转录因子和辅因子确实需要对组织进行光固定以获得最佳结果。一些低丰度和/或弱结合转录因子和辅助因子可能需要中等固定(0.1% 甲醛,10 分钟)以获得最佳结果。此外,在使用具有挑战的组织类型(如纤维组织)时,中等固定可能会改善结果。请注意,过度固定会抑制 CUT&RUN 检测。固定的组织样本在使用前可以在 -80°C 下冷冻长达 6 个月。
注:为 CUT&RUN 准备新鲜组织(无固定)时,我们建议在制备组织之前制备伴刀豆球蛋白 A 珠(第二部分,步骤 1 到 5),以尽量减少细胞在珠子制备过程中停留的时间。活化的珠子可以储存在冰上直到准备使用。
注:固定组织制备需要以下试剂,不包含在此试剂盒中:37% 甲醛或 16% 无甲醇的甲醛 #12606、磷酸盐缓冲盐水 (PBS) #9872、甘氨酸溶液 (10X) #7005 和 10% SDS 溶液 #20533。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注意:对于某些转录因子或辅因子,或对于诸如纤维组织之类的困难组织类型,每个反应最多可使用 5 mg 组织而无需按比例放大试剂。
注意:我们建议对组织进行稍稍固定,因为这种条件最适合大多数组织类型和蛋白质靶标。但是,如果需要新鲜组织,请跳过步骤 3 到 8 并立即进行步骤 9。
注意:此体积的固定溶液足以容纳多达 50 mg 的组织。如果处理 >50 mg,则在步骤 7 中相应地增加固定溶液和 1X PBS + PIC 溶液。
注意:对于困难的组织类型(如纤维组织)或低丰度和/或弱结合转录因子或辅因子,将甲醛固定延长至 10 分钟可能会改善结果。
注意:在随后的实验步骤中,将在 55°C 下孵育 input 样品,因此建议使用一根可封盖的 1.5 ml 试管,以减少孵育过程出现蒸发。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
NOTE: Digitonin Solution #16359 should be stored at -20°C. 请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
注意:避免将伴刀豆球蛋白 A 珠悬浮液涡旋,因为反复涡旋可能会使伴刀豆球蛋白 A 从珠子中移位。
注意:为避免珠子丢失,请使用移液管去除液体。请勿使用真空设备抽吸。
注意:如果在细胞或组织制备之前制备伴刀豆球蛋白 A 珠子(如建议用于活细胞和新鲜组织),则活化的珠子可以储存在冰上直至使用。
注意:伴刀豆球蛋白 A 珠子可能会结块或粘附在试管壁上。上下吹打来重悬珠子。无需摇动或振摇样品样管。
注意:CUT&RUN 需要的抗体量不定,应由使用者确定。对于阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751,向样品中添加 2 µl 抗体。对于阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362,向样品中添加 5 µl。我们强烈建议使用阴性对照抗体,而不是非抗体对照,因为后者会导致高水平的非特异性 MNase 消化和高背景信号。我们建议尽可能使用 input 样本与 qPCR 和 NG-seq 分析进行比较。
注意:伴刀豆球蛋白 A 珠子可能会结块或粘附在试管壁上。上下吹打来重悬珠子。无需摇动或振摇样品样管。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注意:洋地黄皂苷溶液 #16359 应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
NOTE: The Digitonin Buffer prepared here will be used for both Section III and IV.
注意:Concanavalin A 磁珠可能会结块或粘附在试管壁上。上下吹打来重悬珠子。无需摇动或振摇样品样管。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注意:洋地黄皂苷溶液 #16359 应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
可选:如需对样品进行标准校对,则可将 Sample Normalization Spike-In DNA 添加到 1X Stop Buffer 中(例如,见第七部分的图 8)。对于 qPCR 分析,我们建议每次反应加入 5 µl (5 ng) Spike-In DNA。对于 NG-seq 分析,我们建议用 Nuclease-free Water #12931 稀释 Sample Normalization Spike-In DNA 100 倍,每次反应加入 5 µl (50 pg) Spike-In DNA。当每次反应使用 100,000 个细胞或 1 mg 组织时,这可确保标准化读数约为总测序读数的 0.5%。如果每个反应使用多于或少于 100,000 个的细胞或 1 mg 组织,按比例放大或缩小样本标准化 Spike-In DNA 的体积,以将标准化读数调整到总读数的 0.5% 左右。
注意:应在 4°C 的冷却块或冰箱中进行消化。冰的温度可低至 0°C,这可能会限制消化并降低信号。无需摇动或振摇样品样管。
注意:如果使用活细胞或新鲜组织(未固定)进行 CUT&RUN 测定,跳过步骤 14-15,然后立即进行步骤 16。
注意:在随后的实验步骤中,将在 65°C 下孵育 input 样品,因此建议使用一根可封盖的 2 ml 试管,以减少孵育过程出现蒸发。
注意:如果样品没有预热到室温,SDS 可能会从溶液中沉淀出来。
输入 DNA 的片段化是与下游 NG 测序兼容所必需的,但对于下游 qPCR 分析则不是必需的。如果没有超声波仪,我们建议使用未片段化的输入 DNA 进行 qPCR 分析;然而,输入 DNA 应使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化,因为未片段化输入 DNA 的尺寸太大而无法使用 DNA 离心柱进行纯化。如果没有超声波仪并且需要进行下游 NG 测序分析,则可以使用 CUT&RUN 正常 IgG 抗体样品作为阴性对照,尽管这并不理想,因为正常的富含 IgG 的样品可能会显示非特异性 DNA 富集。或者,使用 MNase 的输入 DNA 片段化实验步骤可在 https://cst-science.com/CUT-RUN-input-digestion 获得。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在制备的input样品的数量按比例增加。
注意:超声处理条件可能需要根据 附录 B 中的步骤通过测试不同的超声仪功率设置和/或超声处理持续时间来凭经验确定。最佳超声处理条件将产生大小从 100-600 bp 不等的染色质片段。使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探针的 VirTis Virsonic 100 超声波均质器/超声波仪以 5 组 15 秒脉冲进行超声处理,可充分碎裂input染色质。
如 VI - A 部分所述,使用 DNA 离心柱可从input和富集染色质样品中纯化 DNA,或如第 VI - B 部分所述,使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法进行纯化。使用 DNA 离心柱纯化简单快速,可很好地回收 35 bp 以上的 DNA 片段(图 7A,泳道 2)。苯酚/氯仿提取之后再行乙醇沉淀更加困难,但能很好地回收 35 bp 以下的 DNA 片段(图 7A,泳道 3);但如图 7B 所示,大多数在 CUT&RUN 检测中产生的 DNA 片段大于 35 bp。因此,DNA 离心柱提供一种快速简单的方法来纯化 > 98% 的所有 CUT&RUN DNA 片段。
在 NG-seq 分析之前,使用基于 picogreen 的 DNA 定量测定法可以对纯化的 DNA 进行定量。对于含 100,000 个细胞的 CUT&RUN 反应,一次转录因子和辅因子的 CUT&RUN 反应中,预期 DNA 产量为 0.5-10 ng,而在一次组蛋白修饰反应中则为 1-20 ng。
图 7. 比较使用离心柱或苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法进行的 DNA 纯化。(A) 将低量程 DNA 标准品混合物(泳道 1,未纯化)使用 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN,CUT&Tag) #14209(泳道 2)或苯酚/氯仿提取后接乙醇沉淀法(泳道 3)纯化,并通过在 4% 琼脂糖凝胶上电泳来分离。如图所示,苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀能有效回收所有大小的 DNA 片段,而 DNA 离心柱仅能回收 ≥ 35 bp 的 DNA 片段。(B) 在使用 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 的 CUT&RUN 检测中使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化 DNA。使用一台Bioanalyzer (Agilent Technologies) 分析文库中 DNA 片段的大小。在构建期间添加到文库中的接头蛋白和条码序列的片段长度为 140 bp。因此,文库制备后,起始 35 bp 的 DNA 片段长度将变为 175 bp(图中用蓝色垂直线标注)。如图所示,总 CUT&RUN 富集 DNA 片段中不到 2% 短于 175 bp(起始长度 35 bp),提示 DNA 纯化离心柱足以捕获 > 98% 的总 CUT&RUN DNA 片段。
NOTE: DNA can be purified from input and enriched chromatin samples using the DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN, CUT&Tag) #14209 (not included in this kit) and the modified protocol below. 步骤 1-5 已修改,以符合向 300 µl input样品和富集染色质样品中添加 5 倍体积 (1.5 ml) DNA 结合缓冲液的要求。
注意:1 体积样品应使用 5 体积的 DNA 结合缓冲液。
注意:以下试剂是苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀所必需的,不包含在本试剂盒中:苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)、氯仿/异戊醇 (24:1)、3M 乙酸钠 (pH 5.2)、20 mg/ml 糖原、100% 乙醇、70% 乙醇和 1X TE 缓冲液或无核酸酶水 #12931。
注意:如果进行样品标准化,仅CUT&RUN 样品使用Sample Normalization Primer Set分析 。input DNA 不包含Normalization Spike-In DNA。
试剂 | 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl) |
---|---|
Nuclease-free H2O #12931 | 6 μl |
5 µM 引物 | 2 μl |
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 | 10 μl |
a. | 初始变性 | 95°C,3 分钟 |
b. | 变性 | 95°C,15 秒钟 |
c. | 退火和延伸 | 60°C,60 秒钟 |
d. | 重复步骤 b 和 c,共循环 40 次。 |
样品标准化引物组的 C[T] 值 | **qPCR 的标准化系数 | 标准化之前的信号(步骤 5 中计算出的输入百分比) | 标准化之后的信号 | |
样品 1 | 23.31 | 2(23.31-23.31)=1.00 | 24.4% | 24.4%/1.00=24.4% |
样品 2 | 24.24 | 2(23.31-24.24)=0.52 | 12.0% | 12.0%/0.52=23.1% |
样品 3 | 25.08 | 2(23.31-25.08)=0.29 | 6.28% | 6.28%/0.29=21.7% |
样品 4 | 26.30 | 2(23.31-26.30)=0.13 | 2.72% | 2.72%/0.13=20.9% |
**qPCR 的标准化系数 = 2(C[T] 选定样品 – C[T] 其他样品)
图 8. 应用添加的Spike-In DNA对 CUT&RUN 信号进行 qPCR 标准化分析。对数量渐减的 HCT116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 (上小图)或 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499(下小图)进行 CUT&RUN 检测。使用 SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516、SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653、SimpleChIP® Human Β-Actin 3' UTR Primers #13669 和 SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。 每份样品中免疫沉淀 DNA 的数量表示为与 100,000 个细胞的input染色质总量相对应的信号。左图中为非标准化的富集结果。在每次反应中,按照与起始细胞数量成比例的方式添加 Sample Normalization Spike-In DNA。根据每份样品中添加 DNA 所产生的 qPCR 信号差异,将 CUT&RUN 信号标准化为含 100,000 个细胞的样品。右图显示了标准化后的富集。
用这种试剂盒制备的免疫富集 DNA 样品直接兼容 NG-seq。要构建下游 NG-seq DNA 文库,请使用与您的下游测序平台兼容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。对于在 Illumina® 平台上测序,我们建议按照 CUT&RUN DNA 的实验步骤,使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 和 Multiplex Oligos for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 #47538 进行测序。
与酵母对应的unique reads数 | NGS 的标准化系数 | 标准化之前与测试参考基因组对应的unique reads数 | NGS 的标准化系数 = 选定样品的酵母 reads数/其他样品的酵母unique reads数 | |
样品 1 | 219,275 | 219,275/219,275 = 1.00 | 5,077,747 | 5,077,747 X 1.00 = 5,077,747 |
样品 2 | 411,915 | 219,275/411,915 = 0.53 | 9,896,671 | 9,896,671 X 0.53 = 5,268,306 |
样品 3 | 816,235 | 219,275/816,235 = 0.27 | 17,842,773 | 17,842,773 X 0.27 = 4,793,320 |
样品 4 | 1,120,826 | 219,275/1,120,826 = 0.20 | 23,836,679 | 23,836,679 X 0.20 = 4,663,339 |
NGS 的标准化系数 = 选定样品的酵母unique reads数/其他样品的酵母unique reads数
在 CUT&RUN 实验步骤中,向缓冲液中添加洋地黄皂苷能促进细胞膜透化以及一抗和 pAG-MNase 酶进入细胞和胞核。因此,缓冲液中有足量的洋地黄皂苷对抗体和酶的成功结合以及靶向基因位点的消化至关重要。不同细胞系对毛地黄皂苷透化细胞显示不同的敏感性。虽然本实验步骤中建议的洋地黄皂苷量应足以对大多数细胞系或组织进行透化,但您可以使用本实验步骤测试您的特定细胞系或组织。我们发现,添加过量的洋地黄皂苷对本实验没有损害,因此无需生成浓度曲线。所以,进行快速测试以确定建议的洋地黄皂苷量是否适合你的细胞系就足够了。
注意:洋地黄皂苷溶液 #16359 应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
注意:如果肉眼看不到细胞沉淀,我们建议在步骤 2 中对细胞悬浮液进行初始离心后,在不干扰细胞沉淀的情况下去除尽可能多的细胞培养基,并对每个反应留下一些细胞培养基。然后在步骤 3 中,向细胞悬液中加入足够的 1X 洗涤缓冲液,使总体积达到 100 µl。
建议对input DNA 样品进行超声处理,因为 DNA 纯化离心柱只能纯化片段化的基因组 DNA (< 10 kb)。此外,片段化的基因组 DNA (< 1 kb) 可在 NG-seq 分析中用作阴性对照。应优化超声处理,以便input DNA 的长度为 100-600 bp。
我们建议使用input样品进行 NG-seq,因为它能方便且无偏倚的呈现细胞基因组。虽然 IgG 样品也可在 NG-seq 中用作阴性对照,但由于存在非特异性结合,它可能会显示基因组特定区域出现富集。非片段化input DNA 可用于 qPCR 分析。但必须使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化非片段化的 DNA。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在制备的input样品的数量按比例增加。
注意:如果在处理低细胞数(<100,000 个细胞)时肉眼看不到离心后的细胞沉淀,我们建议跳过下面的洗涤步骤 3-5。在步骤 2 中对细胞悬浮液进行初始离心后,在不干扰细胞沉淀的情况下去除尽可能多的细胞培养基,并在每个反应中留下一些细胞培养基。然后在步骤 6 中,将足够的 1X 洗涤缓冲液添加到细胞悬液中,以便在每个被测试的超声处理条件下达到 100 µl 的体积。
主要:在步骤 9 中,在 55°C 下孵育样品,因此建议使用一个可封盖的 1.5 ml 管子,以减少孵育过程中出现蒸发。
有关详细的疑难解答指南,请访问 https://cst-science.com/troubleshooting-CUT-RUN
实验步骤编号:1884
人
使用与人 EOMES 蛋白中 Pro180 周围残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。
T 盒转录因子家族因与小鼠短尾类 (T) 基因产物 DNA 结合域具有共同同源性而得名。该家族成员能结合 DNA 并可转录激活,还具有进化上保守的表达模式,并在胚胎发育(主要是中胚层发育)过程中发挥作用 (1)。EOMES 或 Tbr2(T 盒脑蛋白 2)是中胚层形成的一种主要调节分子,中胚层形成也对滋养层形成、原肠胚形成、神经发生和某些 T 细胞亚群分化必不可少。EOMES 敲除型小鼠胚胎在着床后不久便因不能形成滋养层而死亡 (2,3)。有条件的神经敲除小鼠在特定的神经祖细胞群(称为中间阶段祖细胞 (IPC))的发育中显示缺陷,这些细胞仅产生神经元(4,5)。这类细胞由位于皮质脑室和脑室下区的放射状胶质细胞形成。EOMES 表达随着细胞从放射状胶质细胞发育成中间祖细胞而增加,并随着成中间祖细胞发育成神经元而减少。最近的证据表明,EOMES 和 IPC 可能还在成体海马齿状回颗粒下层 (SGZ) 诱导神经发生 (5)。EOMES 还是记忆 T 细胞以及 CD8+ T 细胞全效应子分化的一个关键转录因子 (6)。在病毒感染和细菌感染后,会在 CD8+ 细胞中诱导 EOMES 表达,从而产生足够的 IL-12 以引发激烈的宿主细胞反应 (7)。
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