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81045
Cyclin F (D9K2U) Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体

Cyclin F (D9K2U) Rabbit mAb #81045

引用 (2)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1: Cyclin F (D9K2U) Rabbit mAb

使用 Cyclin F (D9K2U) Rabbit mAb (上)或 α-Actinin (D6F6) Rabbit mab #6487 (下),对未经处理 (-) 或经胸苷双阻断法同步,随后释放到完全培养基 (+) 中 8 小时的 HT-29 和 U-2 OS 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。

Western Blotting Image 2: Cyclin F (D9K2U) Rabbit mAb

使用 Cyclin F (D9K2U) Rabbit mAb (上)或 Myc-Tag (71D10) Rabbit mAb #2278 (下),对转染空载 (-) 或转染 Myc/DDK 标签的全长人 Cyclin F (hCyclin F-Myc/DDK; +) 的 293T 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

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81045S
100 µl

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支持数据

反应性 H
敏感性 内源性
MW (kDa) 90
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

特异性/敏感性

Cyclin F (D9K2U) Rabbit mAb 可识别 Cyclin F 总蛋白的内源水平。该抗体可通过蛋白质印迹法识别出 80 kDa 的未知蛋白。

物种反应性:

来源/纯化

使用与人 Cyclin F 蛋白 Pro665 周围残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

Cyclin F 是 F-box 蛋白家族的基础成员,存在于所有真核细胞中。F-box 蛋白是 Skp1-Cullin-F-box (SCF) 泛素连接酶复合体的组分。SCF 复合体的底物特异性由可替换的 F-box 蛋白决定,该蛋白通过与磷酸化底物蛋白结合并将其募集到 SCF 中心发挥接头蛋白的作用 (1)。

除了一个 F-box 结构域,cyclin F 还包含一个 cyclin 蛋白盒结构域,但无法调节周期素依赖性激酶的活性。Cyclin F 的表达在细胞周期中上下浮动,在 G2 期达到顶峰 (2)。

Cyclin F 与中心体蛋白 CP110 发生相互作用,后者在中心粒复制和纺锤体形成中发挥重要作用。CP110 在 G2 期通过 cyclin F 介导实现降解,是细胞正常进入有丝分裂所需的 (3)。对引发 DNA 双链断裂的电离辐射作出应答,cyclin F 与 B-Myb 发生相互作用,防止发生 B-Myb 的 cyclin A 依赖型磷酸化和延迟进入有丝分裂期。这个 G2 期停滞使细胞能够对 DNA 损伤诱发的 G2/M 期检查点作出反应 (4)。Cyclin F 也能够控制核苷酸还原酶 M2 亚基 RRM2 的稳定性,而 RRM2 能够维持细胞中用于 DNA 合成与修复的 dNTP 水平,对基因毒性应激作出应答 (5)。研究人员指出,cyclin F 是肝细胞癌 (HCC) 的一个预后标记物 (6)。

  1. Reed, S.I. (2003) Nat Rev Mol Cell Biol 4, 855-64.
  2. D'Angiolella, V. et al. (2013) Trends Cell Biol 23, 135-40.
  3. D'Angiolella, V. et al. (2010) Nature 466, 138-42.
  4. Klein, D.K. et al. (2015) Nat Commun 6, 5800.
  5. D'Angiolella, V. et al. (2012) Cell 149, 1023-34.
  6. Fu, J. et al. (2013) Cancer Sci 104, 508-15.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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