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8698
Cleaved Caspase Substrate Motif [DE(T/S/A)D] MultiMab™ Rabbit mAb mix
一抗
单克隆抗体

Cleaved Caspase Substrate Motif [DE(T/S/A)D] MultiMab™ Rabbit mAb mix #8698

引用 (12)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1: Cleaved Caspase Substrate Motif [DE(T/S/A)D] MultiMab™ Rabbit mAb mix

使用 Cleaved Caspase Substrate Motif [DE (T/S/A)D] MultiMab™ 兔单抗混合物(上)或 GAPDH (D16H11) XP® 兔单抗 #5174 作为内参对照(下)时,NIH/3T3 细胞和 HeLa 细胞(未处理 (-) 或用 Staurosporine #9953 处理(1 μM,3 小时;+))的蛋白质印迹分析。

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支持数据

反应性 所有物种
敏感性 内源性
MW (kDa)
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育,并且轻轻晃动且在室温下孵育 1 小时后,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:263

特异性/敏感性

Cleaved Caspase Substrate Motif [DE (T/S/A)D] MultiMab™ Rabbit mAb mix 可检测 caspase 剪切的带羧基末端天冬氨酸残基,在特殊情况下可检测带羧基末端谷氨酸残基的蛋白质的内源水平。这种抗体不与完整的蛋白质或以不同羧基末端残基结尾的那些蛋白质发生交叉反应。

物种反应性:

预期的所有物种

来源/纯化

针对已批准应用,采用优化比率结合单个兔单克隆体而制备 MultiMab™ 兔单克隆混合抗体。混合物中的每种抗体都是根据多种测定法中的基序识别和性能严格筛选得来。每种混合物尽可能产生最大修饰覆盖范围,同时确保修饰或基序的高度特异性。

背景

凋亡是导致受高度调节、编程形式细胞死亡的生理过程,这个过程是多细胞生物中生长和发育的正常组成部分。caspase是指向天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶,这些蛋白酶在凋亡性机制中处于核心地位 (1)。内源性通路是从细胞内部起源的信号,如 DNA 损伤启动凋亡级联,而外源性通路则是对胞外信号如 FasL 做出反应,启动凋亡。在内源性通路和外源性通路中,起始caspase会剪切下游底物,其中包括多种效应caspase和细胞死亡主要执行者—Caspase-3 (2,3)。效应caspase放大凋亡性级联以靶向正常细胞功能需要的多种关键蛋白质。除其在发育生物学中的作用之外,凋亡的调节对研究癌症、自身免疫性疾病和传染性疾病具有广泛意义 (4)。数千个已知和推定的caspase剪切位点存在于人类蛋白质组内部;几乎全部位点都涉及天冬氨酸残基处的剪切,不过观察到谷氨酸残基处的剪切过程,这实属少数 (5)。

  1. Cohen, G.M. (1997) Biochem. J. 326, 1-16.
  2. Kaufmann, T. et al. (2012) Cell Death Differ 19, 42-50.
  3. Alenzi, F.Q. et al. (2010) Asian Pac J Cancer Prev 11, 271-80.
  4. Favaloro, B. et al. (2012) Aging (Albany NY) 4, 330-49.
  5. Fischer, U. et al. (2003) Cell Death Differ 10, 76-100.

限制使用

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