我们有一个新的 URL!www.cellsignal.cn | 点击了解更多 >>
2360
Chk1 (2G1D5) Mouse mAb
一抗
单克隆抗体

Chk1 (2G1D5) Mouse mAb #2360

引用 (197)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1 - Chk1 (2G1D5) Mouse mAb

使用 Chk1 (2G1D5) Mouse mAb 对来自不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。

Western Blotting Image 2 - Chk1 (2G1D5) Mouse mAb

使用 Chk1 (2G1D5) Mouse mAb #2360和 β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970 对来自被 100 nM SignalSilence® Control siRNA (Fluorescein Conjugate) #6201 (-) 或 SignalSilence® Chk1 siRNA I #6241 或 SignalSilence® Chk1 siRNA II (+) 转染的 Hela 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。Chk1 (2G1D5) Mouse mAb 可证实 Chk1 表达的沉默并且 β-Actin (13E5) Rabbit mAb 可用作 Chk1 siRNA 的载量和特异性的对照。

购买 # 2360S
产品货号 规格 价格 库存
2360S
100 µl

支持数据

反应性 H M R Mk
敏感性 内源性
MW (kDa) 56
来源/亚型 小鼠 IgG1

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

打印

查看 > 折叠 >

蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗:Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (#7076)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(#7076,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody(#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育并伴有轻轻摇晃,在室温下孵育 1 小时,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:19

特异性/敏感性

Chk1 (2G1D5) Mouse mAb 可识别内源水平的Chk1 总蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴

来源/纯化

使用纯化的重组 Chk1 蛋白对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

Chk1 激酶在 ATM/ATR 激酶下游发挥作用并且在 DNA 损伤检查点控制、胚胎发育和肿瘤抑制中起着重要作用 (1)。Chk1 的激活需要在 Ser317 和 Ser345 位点由 ATM/ATR 引起的磷酸化,随后在Ser296 发生自磷酸化。该激活会出现以响应 DNA 复制受阻和某些形式的遗传毒性应激 (2)。在检查点激活后 Ser345 位点的磷酸化促使 Chk1 定位至胞核 (3),而Ser317 位点的磷酸化以及 PTEN 的位点特异性磷酸化则使其在 DNA 复制停顿后可以再进入细胞周期 (4)。Chk1 对细胞周期发挥其检查点机制,在某种程度上是通过调控 cdc25 磷酸酶家族发挥的。cdc25A 的 Chk1 磷酸化导引其供蛋白酶解并且通过 14-3-3 结合作用抑制其活性 (5)。激活的 Chk1 可以通过 Ser216 位点的磷酸化使 cdc25C 失活,从而阻断激活 cdc2 及转变成有丝分裂 (6)。据已表明,中心体 Chk1 可使 cdc25B 磷酸化并抑制其激活 CDK1-细胞周期蛋白 B1,从而终止有丝分裂纺锤体的形成和染色质的凝缩 (7)。另外,Chk1 在纺锤体检查点功能中通过调控 aurora B 和 BubR1 而发挥作用 (8)。调查研究表明,Chk1 可作为癌症治疗的药物靶标,这是由于在许多癌细胞系中对 Chk1 的抑制会导致细胞死亡 (9)。

  1. Liu, Q. et al. (2000) Genes Dev 14, 1448-59.
  2. Zhao, H. and Piwnica-Worms, H. (2001) Mol Cell Biol 21, 4129-39.
  3. Jiang, K. et al. (2003) J Biol Chem 278, 25207-17.
  4. Martin, S.A. and Ouchi, T. (2008) Mol Cancer Ther 7, 2509-16.
  5. Chen, M.S. et al. (2003) Mol Cell Biol 23, 7488-97.
  6. Zeng, Y. et al. (1998) Nature 395, 507-10.
  7. Löffler, H. et al. (2006) Cell Cycle 5, 2543-7.
  8. Zachos, G. et al. (2007) Dev Cell 12, 247-60.
  9. Garber, K. (2005) J Natl Cancer Inst 97, 1026-8.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink