蛋白质印迹法实验步骤
蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。
注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。
A. 溶液与试剂
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
- 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS:将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O,混合。
- 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS):(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS:将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ,混合。
- 1X SDS 样品缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液,配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
- 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液: 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ,混合。
- 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
- 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
- 脱脂奶粉:(#9999)。
- 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
- 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
- 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
- Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
- Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329)。
- 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
- HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
- 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。
B. 蛋白质印迹
制备样品的常规流程。
- 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
- 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
- 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
- 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
- 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
- 微量离心机内离心 5 分钟。
上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。
- 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。
C. 膜封闭和抗体孵育
注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。
I. 膜封闭
- (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
- 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
- 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
II. 一抗孵育
- 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
- 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
- 将膜与 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育,并且轻轻晃动且在室温下孵育 1 小时后,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
- 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
- 继续进行检测(D 部分)。
D. 蛋白质检测
使用说明:
- 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
- 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
- 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。
* 避免反复接触皮肤。
发布时间 2005 年 6 月
修订时间 2020 年 6 月
实验步骤编号:263
天然蛋白质免疫沉淀法
本实验步骤适用于使用蛋白 A 磁珠分离法对天然蛋白进行免疫沉淀,以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。
A. 溶液与试剂
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
- 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS,将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O 中并混合。
10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。
注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。
- 3X SDS上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。
- Protein A Magnetic Beads:(#73778)。
- 磁分离架:(#7017) 或 (#14654)。
- 10X 激酶缓冲液(用于激酶试验):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
- ATP (10 mM)(用于激酶试验):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM),将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。
B. 制备细胞裂解物
- 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
- 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
- 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
- 从板上刮下细胞,把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
- 在冰上进行 3 次超声破碎,每次 5 秒。
- 在 4°C,在 14,000 x g 条件下,微量离心 10 分钟,将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。
C. 免疫沉淀法
细胞裂解物预澄清(可选)
强烈建议进行细胞裂解物预清除步骤,以减少结合 Protein A Magnetic beads 的非特异性蛋白。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。
- 稍微涡旋母液试管,以重悬磁珠。
重要提示:使用前,预先洗涤 #73778 磁珠:
- 转移 20 μl 珠浆到一根干净的试管中。将试管放在磁分离架上 10-15 秒钟。
一旦溶液变澄清,便小心清除缓冲液。添加 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液到磁珠沉淀物中,稍微涡旋以洗涤珠子。将试管放回磁分离架。一旦溶液变澄清,便清除缓冲液。再次进行洗涤步骤。
- 添加 200 μl 细胞裂解物到 20 μl 预先洗涤的磁珠中。
重要提示:最佳裂解物浓度将取决于目的蛋白的表达水平。建议起始浓度为 250 μg/ml-1.0 mg/ml。
- 在室温下旋转孵育 20 分钟。
- 使用一个磁分离架将珠子与裂解物分离,并将预澄清的裂解物转移到一根干净的试管中,随后去除磁珠沉淀物。
- 继续进行免疫沉淀部分。
免疫沉淀法
重要提示:强烈建议使用相应的同型对照,以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗,把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗,把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗,把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗,把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗,Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。
- 将一抗(按产品数据表中建议的合适稀释比例)添加到 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜,从而形成免疫复合物。
- 预先洗涤磁珠(参见细胞裂解物预澄清部分,步骤 1 和 2)。
- 将裂解物和抗体(免疫复合物)溶液转移到一根含有已洗涤磁珠沉淀物的试管中。
- 室温下振摇孵育 20 分钟。
- 使用磁性分离架将磁珠沉淀小球。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
- 继续使用免疫印迹法或激酶活动进行分析(D 部分)。
D. 样品分析
继续下述其中一项的具体步骤。
用蛋白免疫印迹法进行分析
- 在 20-40 µl 3X SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物,稍微涡旋以混匀,随后稍微微量离心分离来让样品沉淀。
- 将样品加热到 95–100°C,并持续 5 分钟。
- 使用磁性分离架将磁珠沉淀小球。将上清液转移到新试管。上清液为样品。
- 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。
注意:为了最大限度减少变性 IgG 重链 (~50 kDa) 产生的遮盖作用,我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP 缀合物 #5127)。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)
用激酶活性测定法进行分析
- 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
- 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物,并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
- 30°C 条件下孵育 30 分钟。
- 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
- 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
- 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 1 分钟。
- 将样品 (15-30 µl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。
发布时间 2008 年 12 月
修订时间 2021 年 4 月
实验步骤编号:410