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40623
CD6 (E9Y7Y) Rabbit mAb
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CD6 (E9Y7Y) Rabbit mAb #40623

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筛选器：
  1. WB
  2. IHC
Western Blotting Image 1: CD6 (E9Y7Y) Rabbit mAb
使用 CD6 (E9Y7Y) 兔单克隆抗体（上图）和 β-肌动蛋白 (D6A8) 兔单克隆抗体 #8457（下图）对 HuT 102、人源 CD4+ T 细胞和 HeLa 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。在有 human interleukin-2 (hIL-2) #8907 (6.7 ng/ml) 的情况下，CD4+ T 细胞用人血进行纯化，并使用偶联有 CD3 和 CD28 抗体的珠子刺激 9 天。
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使用 CD6 (E9Y7Y) 兔单克隆抗体对石蜡包埋的人乳腺导管癌细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 2: CD6 (E9Y7Y) Rabbit mAb
使用 CD6 (E9Y7Y) 兔单克隆抗体对石蜡包埋的 Jurkat 细胞沉淀物（左图，阳性）或 293T 细胞沉淀物（右图，阴性）进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 3: CD6 (E9Y7Y) Rabbit mAb
使用 CD6 (E9Y7Y) 兔单克隆抗体对石蜡包埋的人结肠癌细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 4: CD6 (E9Y7Y) Rabbit mAb
使用 CD6 (E9Y7Y) 兔单克隆抗体对石蜡包埋的人鳞状细胞肺癌细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 5: CD6 (E9Y7Y) Rabbit mAb
使用 CD6 (E9Y7Y) 兔单克隆抗体对石蜡包埋的人非霍奇金氏淋巴瘤细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 6: CD6 (E9Y7Y) Rabbit mAb
使用 CD6 (E9Y7Y) 兔单克隆抗体对石蜡包埋的人前列腺癌细胞进行免疫组织化学分析。
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40623S		 100 µl

定制制剂

支持性数据

反应性 H
灵敏度 内源性
MW (kDa) 100-140
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫组织化学（石蜡） 1:200

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹，在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜，同时柔和振摇。

注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测，进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O，混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ，混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液： 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ，混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
  14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：10

免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇，组织级（100% 和 95%）。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精（可选）。
  5. 洗涤缓冲液：
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112)。
  7. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  8. 3% 过氧化氢：要制备 100 ml，添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备 4 mL of dH2O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统：SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
  11. 底物：SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  12. 苏木精： Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂： SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤：
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐：将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液，并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 使 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
  9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中，使用前充分混合。
  12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB，并密切观察，通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

检测试剂/底物兼容性
推荐的
检测试剂		 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
兼容的
色原		 SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632 SignalStain® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit #12824
SignalStain® Deep Black Peroxidase Substrate Kit #72986  
SignalStain® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit #69644  

注意：使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗，考虑到检测试剂的不同灵敏度。


发布​时间 2010 年 2 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：283

特异性/灵敏度

CD6 (E9Y7Y) 兔单克隆抗体可检测 CD6 总蛋白的内源水平。

物种反应性：

人

来源/纯化

使用对人 CD6 蛋白的氨基末端具有特异性的重组蛋白对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

T 细胞分化抗原 CD6 是一种在未成熟胸腺细胞和成熟 T 细胞中表达的细胞黏附分子，并且还可在免疫系统内的部分 B 细胞和自然杀伤细胞中检测到 (1-4)。CD6 可通过其结合伴侣 CD166/ALCAM 介导细胞间相互作用 (2)，并促进免疫突触的形成和成熟 (3,4)。CD6 可作为一个共刺激受体，它通过 TCR/CD3 复合体信号转导级联促进 T 细胞激活和增殖 (3-6)。研究表明，CD6 在丝氨酸和苏氨酸残基上被糖基化 (7) 和过度磷酸化 (8)，在酪氨酸残基上被磷酸化 (6,9)，而每一种作用都会对这个分子的功能和信号转导产生不同影响。CD6 还可作为一个不依赖于钙离子形式的受体，可结合和聚合革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。在脂多糖刺激下，CD6 介导炎症反应的激活和促炎性细胞因子的分泌 (10)。
  1. Bowen, M.A. et al. (1997) J Immunol 158, 1149-56.
  2. Hassan, N.J. et al. (2004) Eur J Immunol 34, 930-40.
  3. Gimferrer, I. et al. (2004) J Immunol 173, 2262-70.
  4. Zimmerman, A.W. et al. (2006) Blood 107, 3212-20.
  5. Roncagalli, R. et al. (2014) Nat Immunol 15, 384-392.
  6. Hassan, N.J. et al. (2006) Mol Cell Biol 26, 6727-38.
  7. Escoda-Ferran, C. et al. (2014) FEBS Lett 588, 2805-13.
  8. Swack, J.A. et al. (1991) J Biol Chem 266, 7137-43.
  9. Wee, S. et al. (1993) J Exp Med 177, 219-23.
  10. Sarrias, M.R. et al. (2007) Proc Natl Acad Sci U S A 104, 11724-9.

通路与蛋白质

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限制使用

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