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62133
CD54/ICAM-1 (VF27-516) Mouse mAb
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CD54/ICAM-1 (VF27-516) Mouse mAb #62133

引用 (2)
筛选器：
  1. IF
  2. F
Immunofluorescence Image 1: CD54/ICAM-1 (VF27-516) Mouse mAb
使用 CD54/ICAM-1 (VF27-516) 小鼠单克隆抗体（绿色）对未经（左图，阴性）或已经 hTNF-α #8902（10 ng/mL，6 小时；右图，阳性）处理的 A549 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色= Hoechst 33342 #4082（DNA 荧光染料）。
Flow Cytometry Image 1: CD54/ICAM-1 (VF27-516) Mouse mAb
使用 CD54/ICAM-1 (VF27-516) Mouse mAb（实线）或浓度匹配的 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415（虚线）对未经处理（蓝色）或已经过 hTNF-α #8902（10 μg/ml，6 小时；绿色）处理的 A549 细胞进行流式细胞分析。Anti-mouse IgG (H+L)，F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4408 作为二抗。
Flow Cytometry Image 2: CD54/ICAM-1 (VF27-516) Mouse mAb
使用 CD54/ICAM-1 (VF27-516) Mouse mAb（实线）或浓度匹配的 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415（虚线）对活性 Jurkat 细胞（蓝色，低表达）和 Raji 细胞（绿色，高表达）进行流式细胞分析。使用 Anti-mouse IgG (H+L)， F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4408 作为二抗。
Flow Cytometry Image 3: CD54/ICAM-1 (VF27-516) Mouse mAb
使用 CD54/ICAM-1 (VF27-516) Mouse mAb（实线）或浓度匹配的 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415（虚线）对固定和透化的 Jurkat 细胞（蓝色，低表达）和 Raji 细胞（绿色，高表达）进行流式细胞分析。Anti-mouse IgG (H+L)，F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4408 作为二抗。
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62133S		 100 µl

定制制剂

支持性数据

反应性 H
灵敏度 内源性
MW (kDa)
来源/同种型 小鼠 IgG1

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
免疫荧光法（免疫细胞化学） 1:500
流式细胞术（固定/通透） 1:200 - 1:800
流式细胞术（活性） 1:200 - 1:800

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。

实验步骤

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免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

若想获得高质量的免疫荧光图片，请使用我们 #12727 Immunofluorescence Application Solutions Kit 中高效且划算的预制试剂。

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭缓冲液：（1X PBS / 5% 常规血清/ 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如 Normal Goat Serum (#5425) 添加至 9 ml 1X PBS）并充分混合。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液： (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (#9998)，并混合。

  5. 建议使用荧光物质标记的 Anti-Mouse 二抗：

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。

    注意：甲醛有毒性，需在通风橱中使用。

  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
  9. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

发布​时间 2006 年 11 月

修订时间 2013 年 11 月

实验步骤编号：148

流式细胞术 Triton™ X-100 小鼠抗体通透实验步骤

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂均可与我公司的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Triton™ X-100) #51995 一并高效购买，或使用下文所列的货号单独购买。

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1 X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：要配制 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水，混合。
  2. 4% 甲醛，无甲醇 (#47746)
  3. 细胞透化缓冲液：购买即用型 (#39487) ，或要配制 10 ml，请添加 30 µl Triton™ X-100 到 10 ml 抗体稀释液。4°C 保存。
  4. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释液 (#13616)，或要配制 100 ml，请在 100 ml 1X PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998)。4°C 保存。
  5. 建议的抗小鼠二抗：
    • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab′)2 Fragment (Alexa® 488 Conjugate) #4408
    • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab′)2 Fragment (Alexa® 594 Conjugate) #8890
    • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab′)2 Fragment (Alexa® 647 Conjugate) #4410
    • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab′)2 Fragment (PE Conjugate) #59997

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活力指示染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品网页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定与透化

注：固定前，贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

注：最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

注：如果使用全血，则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

注：如果表位遭甲醛和/或 Triton™ X-100 破坏，则可在固定前添加靶向 CD 标志物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。如果您不确定，请进行小规模实验。

  1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
  3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
  4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。
  5. 在每一百万个细胞约 100 μl 细胞透化缓冲液中重悬细胞。
  6. 在室温孵育 10 分钟。
  7. 继续进行染色或将细胞在 PBS 中 -4°C 保存过夜。

C. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次检测用 5x105 至 1x106 个细胞）。
  2. 将细胞离心，弃去清液。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
  4. 室温 (20-25°C) 孵育 1 小时。
  5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  6. 在 100 µl 稀释的荧光素偶联的二抗（按建议的稀释比例用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
  7. 在室温 (20-25°C) 下孵育 30 分钟。避光。
  8. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  9. 在 1X PBS 中重悬细胞，在流式细胞分析仪上分析。

发布​时间 2017 年 1 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：1345

针对非偶联小鼠抗体的活细胞实验步骤（流式细胞术）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：若要制备 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水，混合。
  2. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。
  3. 建议使用 Anti-Mouse 二抗：
    • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4408
    • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8890
    • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4410
    • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (PE Conjugate) #59997

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活力指示染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品网页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

注意：如果使用全血，则需裂解红血细胞，并在免疫染色之前通过离心分离洗涤。

注：最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

  1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次测定 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。）
  2. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
  4. 在冰上孵育 30 分钟至 1 小时。避光。
  5. 用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤。弃去上清液。重复。
  6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗（按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
  7. 在冰上孵育 30 分钟。避光。
  8. 用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤。弃去上清液。重复。
  9. 在 200-500 μl 抗体稀释缓冲液中重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。

发布​时间 2011 年 2 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：58

特异性/灵敏度

CD54/ICAM-1 (VF27-516) 小鼠单克隆抗体 可检测 CD54/ICAM-1 总蛋白的内源水平。

物种反应性：

人

来源/纯化

使用经 SDS 变性、福尔马林固定培养的 COLO-38 人黑色素瘤细胞对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

分子间细胞黏附分子-1 (CD54 或 ICAM-1) 是属于黏附分子免疫球蛋白超家族 (IgSF) 的细胞表面糖蛋白。CD54 以低水平在多样的细胞类型中表达并且由细胞因子（TNF-α、白介素-1）和细菌脂多糖 (1) 诱导。CD54 在内皮细胞上顶端定位（或在上皮细胞上基底外侧定位）是白细胞跨内皮（或上皮）屏障转运的前提 (1)。CD54 在上皮细胞上的顶端表达介导病原体侵入以及宿主防御，该模式还在肿瘤中观察到 (1)。CD54 还作为抗原呈递细胞上的辅助刺激物发挥作用，在抗原呈递期间与 T 细胞表面上其受体 LFA-1（白细胞功能相关抗原-1）结合 (2)。CD54 交联与其配体的结合触发 Src 家族激酶和 Rho/ROCK 通路的激活 (3-7)。在 CD54 的 Tyr485 上的磷酸化是其与结合 SHP-2 需要的 (5)。SHP-2 似乎对 CD54-诱导的 Src 活化必不可少 (7)。
  1. Hopkins, A.M. et al. (2004) Adv Drug Deliv Rev 56, 763-78.
  2. Nishibori, M. et al. (2003) J Pharmacol Sci 92, 7-12.
  3. Holland, J. and Owens, T. (1997) J Biol Chem 272, 9108-12.
  4. Etienne, S. et al. (1998) J Immunol 161, 5755-61.
  5. Pluskota, E. et al. (2000) J Biol Chem 275, 30029-36.
  6. Muro, S. et al. (2003) J Cell Sci 116, 1599-609.
  7. Wang, Q. et al. (2003) J Biol Chem 278, 47731-43.

通路与蛋白质

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