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63000
CD47 (D3O7P) Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体

CD47 (D3O7P) Rabbit mAb #63000

引用 (1)
筛选器:
  1. WB
  2. IHC
Western Blotting Image 1: CD47 (D3O7P) Rabbit mAb
使用 CD47 (D3O7P) Rabbit mAb(上图)或 COX IV (3E11) Rabbit mAb #4850(下图),对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。
Immunohistochemistry Image 1: CD47 (D3O7P) Rabbit mAb
在 Leica® BOND Rx 上使用 CD47 (D3O7P) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人尿路上皮癌细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 2: CD47 (D3O7P) Rabbit mAb
在 Leica® BOND Rx 上使用 CD47 (D3O7P) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人卵巢浆液性癌细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 3: CD47 (D3O7P) Rabbit mAb
在 Leica® BOND Rx 上使用 CD47 (D3O7P) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人 B 细胞非霍奇金氏淋巴瘤细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 1: CD47 (D3O7P) Rabbit mAb
使用 CD47 (D3O7P) Rabbit mAb 对石蜡包埋的 OVCAR3 细胞沉淀物(左图,阳性)或 Hep G2 细胞沉淀物(右图,阴性)进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 2: CD47 (D3O7P) Rabbit mAb
使用 CD47 (D3O7P) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人结肠癌细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 3: CD47 (D3O7P) Rabbit mAb
使用 CD47 (D3O7P) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人鳞状细胞肺癌细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 4: CD47 (D3O7P) Rabbit mAb
使用 CD47 (D3O7P) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人卵巢浆液性癌细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 5: CD47 (D3O7P) Rabbit mAb
以浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900(右图)作为对照,使用 CD47 (D3O7P) Rabbit mAb(左图)对石蜡包埋的人前列腺癌细胞进行免疫组织化学分析。
To Purchase # 63000S
产品货号 规格 价格 库存
63000S
100 µl

支持数据

反应性 H
敏感性 内源性
MW (kDa) 45-50
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
IHC-Leica® Bond™ 1:100 - 1:400
免疫组织化学(石蜡) 1:100 - 1:400

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

免疫组织化学 (Leica® BOND™)

:请参阅产品数据表或产品网页,了解合适的抗体稀释度^。

  步骤 试剂 时间/温度
1 脱蜡 BOND™ Dewax Solution、100% 乙醇、BOND™ Wash Solution 预编程的 Leica® BOND™ 
2 抗原修复  BOND™ Epitope Retrieval ER2 Solution 20 分钟,100˚C | 实验步骤:用 ER2 进行 20 分钟的热诱导表位修复 (HIER)
3 过氧化物封闭液 Refine Detection Kit Peroxide Block* 5 分钟
  洗涤 BOND™ Wash Solution  3x 0:00 分钟
4 蛋白封闭液(可选) #5425 NGS 或 #15019 Animal-Free Blocking Solution   20 分钟 
5 一抗^ 用 #8112 SignalStain® Antibody Diluent 稀释 30 分钟 
  洗涤 BOND™ Wash Solution  3x 2:00 分钟
不适用 Post Primary Mouse Linker Refine Detection Kit Post Primary*  不适用 
6 二次检测 Refine Detection Kit Polymer*  10 分钟 
  洗涤 BOND™ Wash Solution/Deionized Water 定制(参见下文)
7a 可视化 Refine Detection Kit Mixed DAB Refine*  0:00 分钟 
7b 可视化 Refine Detection Kit Mixed DAB Refine*  10 分钟 
  洗涤 去离子水 3x 0:00 分钟
8 复染 Refine Detection Kit Hematoxylin*  5 分钟 
  洗涤 去离子水 0:00 分钟 
  洗涤 BOND™ Wash Solution  0:00 分钟 
  洗涤 去离子水 0:00 分钟 
9 脱水(离线):    
  在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。  
  在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。  
  在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。  
10 用盖玻片和 #14177 SignalStain® Mounting Medium 封片。  
       
  可选订制洗涤: BOND™ Wash Solution 2:00
    BOND™ Wash Solution 分液器类型:开放式 0:00
    BOND™ Wash Solution 2:00
    BOND™ Wash Solution 分液器类型:开放式 0:00
    BOND™ Wash Solution 0:00
    去离子水 0:00

*BOND™ Polymer Refine Detection Kit(货号:DS9800)中所含的试剂

LEICA® 是 Leica Microsystems IR GmbH 的注册商标。

BOND™ 是 Leica Biosystems Melbourne Pty. Ltd 的商标。CST 和 Leica Microsystems IR GmbH 或 Leica Biosystems Melbourne Pty. Ltd 之间没有附属或赞助关系。

发布​于 2018 年 8 月 

修订于 2018 年 9 月

实验步骤编号:1444

免疫组织化学(石蜡)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精(可选)。
  5. 洗涤缓冲液
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液:要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112).
  7. 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  8. 3% 过氧化氢:要制备 100 ml,添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备 4 mL of dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
  11. 底物:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  12. 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐:将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液,并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 使 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中,使用前充分混合。
  12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB,并密切观察,通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

检测试剂/底物兼容性
推荐的
检测试剂
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
兼容的
色原
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632  

注意:使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗,考虑到检测试剂的不同灵敏度。


发布​于 2010 年 2 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:283

特异性/敏感性

CD47 (D3O7P) Rabbit mAb 可识别内源水平的 CD47 总蛋白。

物种反应性:

来源/纯化

通过采用与人 CD47 蛋白的 Leu72 周围的残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

CD47 是一种在所有正常细胞中表达的 5 次跨膜蛋白。它结合在骨髓细胞(包括巨噬细胞)和中枢神经系统神经元细胞中表达的 SIRPα。CD47 结合 SIRPα 会促进 SIRPα 细胞浆尾区内免疫受体酪氨酸抑制基序 (ITIM) 中的酪氨酸残基磷酸化,
从而抑制巨噬细胞吞噬表达 CD47 的细胞。这样,CD47 充当一种“别吃我”信号或“自己”的标记物,从而作为一个先天性免疫检查点发挥作用。此外,有报道称 CD47 可调节淋巴细胞激活和增殖 (1-3)。CD47 在许多癌症类型的细胞中过表达。CD47 在癌细胞中的表达水平与治疗响应呈负相关,在肿瘤细胞中的低表达与较好的预后和存活率有关。目前正在积极探索可阻断 CD47-SIRPα 相互作用的试剂是否可用于治疗应用 (4,5)。除 SIRPα 外,还报道了结合 CD47 的其他蛋白。血小板反应蛋白 1 (TSP1) 与 SIRPα 竞相结合胞外区域中的 CD47,并激活信号转导通路下游 CD47 (6)。在不同环境下,CD47 侧向结合 VEGFR2、FAS 和某些整合素,并影响它们的下游信号转导 (7-9)。溶蛋白性裂解会使 CD47 从细胞表面上脱落。此外,CD47 存在于外来体等胞外囊泡中,表明存在其他胞外信号转导潜能 (10)。
  1. Murata, Y. et al. (2014) J Biochem 155, 335-44.
  2. Legrand, N. et al. (2011) Proc Natl Acad Sci U S A 108, 13224-9.
  3. Barclay, A.N. and Van den Berg, T.K. (2014) Annu Rev Immunol 32, 25-50.
  4. Weiskopf, K. (2017) Eur J Cancer 76, 100-109.
  5. Matlung, H.L. et al. (2017) Immunol Rev 276, 145-164.
  6. Roberts, D.D. et al. (2012) Matrix Biol 31, 162-9.
  7. Kaur, S. et al. (2010) J Biol Chem 285, 38923-32.
  8. Azcutia, V. et al. (2013) Mol Biol Cell 24, 3358-68.
  9. Quesada, A.J. et al. (2005) Cell Death Differ 12, 649-58.
  10. Soto-Pantoja, D.R. et al. (2015) Crit Rev Biochem Mol Biol 50, 212-30.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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