CD34 (ICO115) Mouse mAb #3569

免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

1. 二甲苯
2. 乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）
3. 去离子水 (dH₂O)
4. Hematoxylin（可选）
5. 洗涤缓冲液：
   1. 含 Tween^® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween^® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH₂0 中并混合。
   2. 抗体稀释剂 TBST/5% Normal Goat Serum：向 5 mL 1X TBST 中添加 250 µl Normal Goat Serum #5425)。
6. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH₂O 中。
7. 3% 过氧化氢：要制备，添加10 ml 30% H₂O₂至90 ml dH₂O 中。
8. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
   1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
   2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备 4 mL of dH₂O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
9. 检测系统： VECTASTAIN^® Elite ABC，包括生物素化二抗 (Vector Laboratories)。
10. 底物：Vector^® NovaRED™ (Vector Laboratories)。
11. 苏木精： Hematoxylin (#14166)。
12. 封片剂： SignalStain^® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐：将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
5. 在每个切片上滴加 100–400 µl 首选封闭液，在室温下封闭 1 小时。
6. 清除封闭液，然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的 100–400 µl 的一抗。4°C 温度下孵育过夜。
7. 根据制造商建议说明制备 ABC 溶液。
8. 清除一抗，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
9. 将每个切片中添加 100-400 µl 生物素化二抗（根据制造商建议在 TBST 中进行稀释）。在室温孵育 30 分钟。
10. 清除二抗溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
11. 按需使用 100-400 µl 预混合 ABC 溶液覆盖切片，并在湿盒中室温孵育 30 分钟。
12. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
13. 根据制造商建议说明制备 Vector^® NovaRED™。
14. 在每张切片上应用 100–400 µl 底物并密切观察，通常 1-10 分钟即可得到合适的染色强度。
15. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
16. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
17. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
18. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

针对非偶联小鼠抗体的活细胞实验步骤（流式细胞术）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：若要制备 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水，混合。
2. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。
3. 建议使用 Anti-Mouse 二抗：
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4408
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #8890
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4410
   • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (PE Conjugate) #59997

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活力指示染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品网页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

注意：如果使用全血，则需裂解红血细胞，并在免疫染色之前通过离心分离洗涤。

注：最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次测定 5 x 10⁵ 至 1 x 10⁶ 个细胞。）
2. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
4. 在冰上孵育 30 分钟至 1 小时。避光。
5. 用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤。弃去上清液。重复。
6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗（按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
7. 在冰上孵育 30 分钟。避光。
8. 用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤。弃去上清液。重复。
9. 在 200-500 μl 抗体稀释缓冲液中重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。