CBX4 (E6L7X) Rabbit mAb #30559

染色质免疫沉淀法

特定产品: SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005。

所需的试剂

包括的试剂：

1. Glycine Solution (10X) #7005
2. Buffer A (4X) #7006
3. Buffer B (4X) #7007
4. ChIP Buffer (10X) #7008
5. ChIP Elution Buffer (2X) #7009
6. 5 M NaCl #7010
7. 0.5 M EDTA #7011
8. ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006
9. DNA Binding Buffer #10007
10. DNA Wash Buffer（使用前添加 4x 体积乙醇）#10008
11. DNA Elution Buffer #10009
12. DNA Purification Columns and Collection Tubes #10010
13. Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012
14. RNAse A (10 mg/ml) #7013
15. Micrococcal Nuclease #10011
16. Proteinase K (20 mg/ml) #10012
17. SimpleChIP^® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014
18. SimpleChIP^® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015
19. Histone H3 (D2B12) XP^® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620
20. Normal Rabbit IgG #2729
21. DTT (Dithiothreitol) #7016

未包括的试剂：

1. Magnetic Separation Rack #7017 / 14654
2. Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872
3. Nuclease-free Water #12931
4. 乙醇 (96-100%)
5. 甲醛（37% 母液）
6. SimpleChIP^® Universal qPCR Master Mix #88989

I. 组织交联和样品制备

当收获组织时，去除样品上不需要的材料，如脂肪和坏死组织。随后可以立即处理并交联组织，或在干冰上冷冻并储存于 -80°C 以待稍后处理。为获得最佳的染色质产率和 ChIP 结果，每次进行免疫沉淀法测试时，使用 25 mg 的组织。不同组织类型的染色质产率也不尽相同，并且一些组织在每次免疫沉淀法测试需要超过 25 mg。有关不同组织类型的预期染色质产率的更多信息，请参见附录 A。额外需要一份染色质样品进行染色质消化和浓度分析（第四部分）。如果需要，应处理额外五份染色质样品，以最优化染色质消化（附录 B）。

在开始之前：

(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中 IP 制备物的数量成比例的增加。

• 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) 和 10X Glycine Solution。确保 PIC 完全解冻。
• 对每 25 mg 待处理组织，制备 3 ml 磷酸盐缓冲液 (PBS) + 15μl 200X PIC 并置于冰上。
• 对于每 25 mg 待处理组织，制备 45μl 37% 甲醛并置于室温下贮存。在制造商规定的有效期内使用新鲜甲醛。

A. 交联

1. 称重新鲜或冷冻的组织样品。每次免疫沉淀法使用 25 mg 组织进行实验（一次实验至少需要 75 mg 组织以包含阳性和阴性对照）。
2. 将组织样品置于 60 mm 或 100 mm 培养皿中并用干净的解剖刀或剃须刀片切碎。将培养皿放在冰上。重要的是将组织置于低温下以防止蛋白质降解。
3. 将切碎的组织转移至 15 ml 锥形试管。
4. 对于每 25 mg 组织，添加 1 ml PBS+ PIC 到锥形试管。
5. 为了使蛋白质与 DNA 交联，向每 1 ml PBS + PIC 中添加 45μl 37% 甲醛并在室温下振摇 20 分钟。甲醛最终浓度是 1.5%。
6. 向每 1 ml PBS + PIC 中添加 100 μl 10X 甘氨酸以终止交联并在室温下混合 5 分钟。
7. 将组织置于台式离心机中，在 4℃ 下以 500 x g 的速度离心 5 分钟。
8. 移除上清液并用 1 ml PBS+ PIC/25 mg 组织洗涤一次。
9. 将组织置于台式离心机中，在 4℃ 下以 500 x g 的速度重复离心 5 分钟。
10. 移除上清液，对于每 25 mg 组织，将组织重悬于 1 ml PBS + PIC 中并置于冰上贮存。使用 Medimachine（B 部分）或 Dounce 匀浆器（C 部分），将组织分离成单细胞悬液。（安全停止）或者，样本裂解前在 -80°C 条件下最多可保存 3 个月。

B. 使用 BD Biosciences 的 Medimachine（部件号 340587）离散组织

1. 切去 1000 μL 移液器吸头的末端以扩大开口，用以转移组织块。
2. 将 1 ml 重悬于 PBS + PIC 中的组织转移到 50 mm Medicone（部件号 340592）的顶部室。
3. 根据制造商的说明，研磨组织 2 分钟。
4. 使用 1 ml 注射器和 18 号钝头针，从 Medicone 的底部室收集细胞悬液。将细胞悬液转移至 15 ml 锥形试管并置于冰上。
5. 重复步骤 2 至 4，直到全部组织均处理成均匀悬液。
6. 如果需要更充分地碾磨，则向组织中添加更多的 PBS + PIC。重复步骤 2 至 5，直到全部组织均研磨成均匀悬液。
7. 用显微镜检查单细胞悬液（可选）。
8. 将组织置于台式离心机中，在 4℃ 下以 2,000 x g 的速度离心 5 分钟。
9. 从细胞移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。

C. 使用 Dounce 匀浆器离散组织

1. 将重悬于 PBS + PIC 中的组织转移至 Dounce 匀浆器。
2. 敲击 20-25 次离散组织小片。用显微镜检查单细胞悬液（可选）。
3. 将细胞悬液转移至 15 ml 锥形试管并置于台式离心机中在 4℃ 下以 2,000 x g 离心 5 分钟。
4. 从细胞移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。

II. 细胞培养物交联和样品制备

为达到最佳染色质免疫沉淀法结果，每次免疫沉淀法使用大约 4 X 10⁶ 细胞进行实验（至少需要 12 X 10⁶ 个细胞以包含阳性和阴性对照）。对于 Hela 细胞，一次免疫沉淀相当于 15 cm 培养皿所含细胞（在 20 ml 生长培养基中的融合度为 90%）的一半。要进行染色质消化和浓度分析，应当处理一份额外样品（第四部分）。因为每种细胞类型都不相同，我们推荐您在实验中准备一盘额外的细胞，通过使用血球仪或细胞计数器确定细胞的数量。

在开始之前

(!) 所有缓冲液体积应根据使用的 15 cm 组织培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）数量按比例增加。

• 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 和 10X Glycine Solution #7005。确保 PIC 完全解冻。
• 对于每个待处理的 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞），配制 2 ml 磷酸盐缓冲液 (PBS) + 10 μl 200X PIC，并放在冰上。
• 对于每个待处理的 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞），配制 40 ml PBS，并放在冰上。
• 对于每个待处理的 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞），配制 540 μl 37% 甲醛，并保存在室温下。在制造商规定的有效期内使用新鲜甲醛。

1. 为让蛋白与 DNA 交联，每个含有 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿添加 540 μl 37% 甲醛。对于悬浮细胞，添加 540 µl 37% 甲醛到在 20 ml 培养基中悬浮的细胞中（如要对悬浮细胞进行最佳固定，固定时的细胞密度应少于 0.5 x 10⁶ 个细胞/ml）。短暂旋转混匀并置于室温下孵育 10 分钟。甲醛的最终浓度是 1%。添加甲醛可能导致培养基颜色发生变化。
2. 每个含 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿添加 2 ml 10X 甘氨酸，稍微涡旋混合，并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能导致培养基颜色发生变化。
3. 对于悬浮细胞，将细胞转移至 50 ml 锥形试管，置于台式离心机中在 4℃ 下以 500 x g 离心 5 分钟，并用 20 ml 冰冷的 PBS 洗涤沉淀物两次。移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。
4. 对于贴壁细胞，移除培养基和用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞两次，每次都要从培养皿完全移除洗液。
5. 每个 15 cm 培养皿添加 2 ml 冰冷的 PBS + PIC。将细胞刮入冷的缓冲液中。将所有培养皿的细胞混合放入一个 15 ml 锥形试管。
6. 将细胞置于台式离心机中，在 4℃ 下以 2,000 x g 的速度离心 5 分钟。移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。（安全停止）或者，样本在 -80°C 条件下最多可保存 3 个月。

III. 胞核制备和染色质消化

在开始之前

(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中 IP 制备物的数量成比例的增加。

• 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。使用前确保它完全融化。
• 配制 1 M DTT (192.8 mg DTT #7016 + 1.12 ml dH₂O)。确保 DTT 晶体完全溶解。

  (!!) 重要提示：一旦溶解，将 1 M DTT 置于 -20℃ 下存放。

• 取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解。
• 对于每份 IP 制备物，制备 1 ml 1X 缓冲液 A（250 μl 4X Buffer A #7006 + 750 μl 水） + 0.5 μl 1M DTT + 5 μl 200X PIC 并置于冰上。
• 对于每份 IP 制备物，制备 1.1 ml 1X 缓冲液 B（275 μl 4X Buffer B #7007 + 825 μl 水） + 0.55 μl 1M DTT 并置于冰上。
• 对于每份 IP 制备物，制备 100 μl 1X ChIP 缓冲液（10 μl 10X ChIP Buffer #7008 + 90 μl 水）+ 0.5 μl 200X PIC 并置于冰上。

1. 对于每份 IP 制备物，将细胞重悬于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 A + DTT + PIC 中。在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟颠倒试管混匀。
2. 将细胞置于台式离心机中，在 4℃ 下以 2,000 x g 的速度离心 5 分钟从而沉淀胞核。对于每份 IP 制备物，移除上清液并将沉淀物重悬于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 B + DTT 中。对于每份 IP 制备物，重复离心，移除上清液并将沉淀物重悬于 100 μl 1X 缓冲液 B + DTT。将样品转移至 1.5 ml 微量离心管，直至每支试管共装有 1 ml 样品。
3. 向每份 IP 制备物中添加 0.5 μl Micrococcal Nuclease #10011，通过翻转离心管数次进行混合并且在 37℃ 下孵育 20 分钟，同时频繁搅拌，以使 DNA 消化成大约 150-900 bp 的长度。每 3 至 5 分钟翻转进行混合。对于各种组织和细胞系（参见附录 B），可能需要通过预实验确定将 DNA 消化成最佳长度所需 Micrococcal Nuclease 的量。用 0.5 μl Micrococcal Nuclease/4 x 10⁶ 个 Hela 细胞消化的胞核和用 0.5 μl Micrococcal Nuclease/25 mg 组织消化的小鼠肝组织产生了适当长度的 DNA 片段。
4. 向每份 IP 制备物中添加 10 μl 0.5 M EDTA #7011 并将离心管置于冰上 1-2 分钟以终止消化。
5. 置于微量离心机中，在 4℃ 下以 16,000 x g 离心 1 分钟，使胞核沉淀，并移除上清液。
6. 对于每份 IP 制备物，将胞核沉淀物重悬于 100 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中并在冰上孵育 10 分钟。
7. 对于每支 1.5 ml 微量离心管，用几个脉冲对至多 500 μl 裂解物进行声波处理，以破坏胞核膜。脉冲间隔将样品置于湿冰上孵育 30 秒。可以通过在光学显微镜下观察声波处理前后的胞核，确定完全裂解胞核所需的最佳条件。通过使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探头的 VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator，Hela 胞核在 3 组 20 秒脉冲之后完全裂解。或者，可以通过将裂解物置于 Dounce 匀浆器中搅匀 20 次，裂解胞核；但是，裂解可能不完全。
8. 在 4°C 下用微量离心机以 9,400 x g 的离心力离心分离 10 分钟来使裂解物变澄清。
9. 将上清液转移至新试管。（安全停止） 这是交联的染色质制备物，应当置于 -80 ℃ 下贮存直至进一步使用。取出 50 μl 染色质制备物进行染色质消化和浓度分析（第四部分）。这份 50 µl 的样本可以在 -20°C 下过夜保存。

IV. 染色质消化和浓度分析（建议的步骤）

1. 向 50 μl 染色质样品（在第三部分的步骤 9 中制备）中添加 100 μl 无核酸酶水、6 μl 5M NaCl #7010 和 2 μl RNAse A #7013。涡旋混合，并在 37℃ 下孵育样品 30 分钟。
2. 向每份经 RNAse A 消化的样品中添加 2 μl Proteinase K。摇晃混匀并在 65℃ 孵育样品 2 小时。
3. 按第七部分中所述的步骤，使用 DNA 纯化离心柱从样品中纯化 DNA。（安全停止）DNA 样本在 -20°C 条件下最多可保存 6 个月。
4. 在纯化 DNA 后，取出 10 μl 样品并将其与 100 bp DNA 标准品置于 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳以确定 DNA 片段的大小。应当将 DNA 消化成大约 150-900 bp 的长度（1 至 5 个核小体）。
5. 为确定 DNA 浓度，将 2μl 纯化的 DNA 转移至 98 μl 无核酸酶水，以获得 50 倍稀释度并读取 OD₂₆₀ 值。DNA 浓度（以 μg/ml 计）为 OD₂₆₀ x 2,500。最理想的 DNA 浓度应介于 50 和 200 µg/ml 之间。

注意：为了获得最佳的 ChIP 结果，适宜大小和合适浓度的染色质非常关键。染色质过度消化可能会在 PCR 定量时削弱信号。染色质消化不充分可能导致背景信号增加和分辨率降低。向 IP 中添加染色质过少可能导致在 PCR 定量时信号削弱。优化染色质消化的实验步骤可以在附录 B 中找到。

五、染色质免疫沉淀法

为了获得最佳的 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 μg 消化的交联染色质（如第四部分中所测定）。这应当和来自 25 mg 分散的组织或 4 x 10⁶ 个组织培养细胞的单一 100μl IP 制备物大致相等。在添加抗体之前，通常将 100μl 消化的染色质稀释到 400μl 1X ChIP 缓冲液中。但是，如果每次 IP 需要 100 μl 以上的染色质，则交联的染色质制备物不需要按照下述方法进行稀释。可以直接向未稀释的染色质制备物中添加抗体以对染色质复合体进行免疫沉淀测试。

在开始之前

(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。

• 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。
• 取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解。
• 融化消化的染色质制备物（在第三部分的步骤 9 中制备）并置于冰上。
• 制备低盐洗液：每次免疫沉淀法需使用 3 ml 1X ChIP 缓冲液（300 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 2.7 ml 水）。在室温下储存直至使用。
• 制备高盐洗液：每次免疫沉淀法使用 1 ml 1X ChIP 缓冲液（100 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 900 µl 水） + 70 µl 5M NaCl #7010 在室温下储存直至使用。

1. 在一支试管中，制备足量的 1X ChIP 缓冲液，以稀释消化的染色质，达到免疫沉淀所需的数量：每次免疫沉淀法需使用 400 µl 的 1X ChIP 缓冲液（40 µl 的 10X ChIP 缓冲液 + 360 µl 水）+ 2 µl 200X PIC。当确定免疫沉淀次数时，记得纳入阳性对照样品 Histone H3 (D2B12) XP^® Rabbit mAb #4620 和阴性对照样品 Normal Rabbit IgG Antibody #2729。将混合物置于冰上。
2. 对于每次免疫沉淀，向配置的 1X ChIP 缓冲液中添加 100 μl（5 至 10 μg 染色质）等量的消化的交联染色质制备物（在第三部分中的步骤 9 中制备）。例如，要进行 10 次免疫沉淀，需要准备一支含有 4 ml 1X ChIP 缓冲液（400 μl 10X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 μl 200X PIC + 1 ml 消化的染色质制备物的试管。
3. 取出 10 μl 稀释的染色质样品并将其转移至微量离心管。这将作为 2% 样品输入对照，该样品在后续使用之前可以置于 -20℃ 下贮存（第六部分的步骤 1 ）。
4. 对于每次免疫沉淀，将 500 μl 稀释的染色质转移至 1.5 ml 微量离心管并添加免疫沉淀抗体。每次 IP 需要的抗体量不定而且应当由使用者确定。对于阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP^® Rabbit mAb #4620，向 IP 样品中添加 10 μl。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729，向 IP 样品中添加 1μl (1 μg) 至 2 μl (2 μg)。如果使用 Cell Signaling Technology 的抗体，请参考数据手册或产品网页上列出的推荐稀释比例，并根据 Cell Signaling 抗体浓度计算 IgG 抗体的量 (µg) 作为阴性对照，这样才能公正的比较。将 IP 样品在 4℃ 下转动孵育 4 小时至过夜。

   注意：Cell Signaling Technology 抗体在每份处于 1 和 2 ug 之间 IP 样品会取得最佳效果。当存在多份不同浓度的样品时，最好使阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。

5. 轻轻涡旋混合，重悬 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006。立即向每 IP 反应中添加 30 μl Protein G Magnetic Beads 并在 4°C 下转动孵育 2 小时。
6. 将试管置于 Magnetic Separation Rack #7017 上，使每次免疫沉淀中的 Protein G Magnetic Beads 沉淀。等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清，然后小心地移除上清液。
7. 向微珠中添加 1 ml 低盐洗液，对 Protein G Magnetic Beads 进行洗涤，然后在 4°C 下转动孵育 5 分钟。再重复步骤 6 和 7 两次，以确保总共进行 3 次低盐洗涤。
8. 向微珠中添加 1 ml 高盐洗液并且在 4℃ 下转动孵育 5 分钟。
9. 将试管置于 Magnetic Separation Rack 上，使每次免疫沉淀中的 Protein G Magnetic Beads 沉淀。等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清，然后小心地移除上清液。立即进入第六部分。

VI. 将染色质从抗体/Protein G Magnetic Beads 上洗脱下来并解交联

在开始之前

(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。

• 取出 2X ChIP Elution Buffer #7009 并置于 37℃ 水浴中加热，并确保 SDS 溶解。
• 将水浴或热混合仪设为 65℃。
• 对于每次免疫沉淀和 2% 样品输入对照，制备 150μl 1X ChIP 洗脱缓冲液（75 μl 2X ChIP Elution Buffer #7009 + 75 μl 水）。

1. 向 2% 样品输入对照管中添加 150 μl 1X ChIP 洗脱缓冲液并置于室温下直至开始进行步骤 6。
2. 向每份 IP 样品中添加 150 μl 1X ChIP 洗脱缓冲液。
3. 轻轻涡旋混合（1,200 转/分钟）并在 65°C 下孵育 30 分钟以将染色质从抗体/Protein G Magnetic Beads 上洗脱下来。对于这个步骤，热混合仪效果最佳。或者，可以在室温下转动洗脱，但是可能不会完全洗脱。
4. 将试管置于磁性分离架中使 Protein G Magnetic Beads 沉淀，然后等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清。
5. 小心地将洗脱下来的染色质上清液转移至新试管。
6. 向所有试管（包括步骤 1 中的 2% 输入样品）中添加 6 μl 5M NaCl 和 2 μl Proteinase K #10012 解交联，并在 65 °C 下孵育 2 小时。这次孵育可以延长过夜。
7. 立即进入第七部分。(安全停止) 或者，样本在 -20°C 条件下最多可保存 4 天。然而，为了避免形成沉淀物，确保在添加 DNA Binding Buffer #10007 之前，将样品加热到室温（第七部分，步骤 1）。

VII. 使用离心柱纯化 DNA

在开始之前

• (!!) 使用前向 DNA Wash Buffer #10008 中添加 24 ml 乙醇 (96-100%)。此操作仅需在第一次DNA纯化前进行。
• 对于第五部分制备的每份 DNA 样品，取出一支 DNA 纯化收集管 #10010。

1. 向每份 DNA 样品中添加 750 μl DNA Binding Buffer #10007 并短暂涡旋混合。
   • 对于每 1 体积样品，应当使用 5 倍体积的 DNA 结合缓冲液。
2. 从在步骤 1 中制备的每份样品中取出 450 μl 并将其至收集管的 DNA 离心柱中。
3. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
4. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
5. 从在步骤 1 中制备的每份样品中取出剩余的 450 μl 并将其转移至收集管的离心柱中。重复步骤 3 和 4。
6. 向收集管的离心柱中添加 750 μl DNA Wash Buffer #10008。
7. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
8. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
9. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
10. 丢弃收集管和液体。保留离心柱。
11. 向每个离心柱中添加 50 μl DNA Elution Buffer #10009 并将其置于洁净的 1.5 ml 微量离心管中。
12. 用微量离心机以 18,000 x g 的离心力离心分离 30 秒，以洗脱 DNA。
13. 取出并丢弃 DNA 离心柱。洗脱物即纯化的 DNA。（安全停止） 样本可以在 -20°C 条件下保存。

八、用 PCR 定量 DNA

建议

• 使用带滤嘴的移液器吸头，从而最大限度地减少污染风险。
• 试剂盒中所含的对照引物专门用于人或小鼠 RPL30 基因（#7014 + #7015）并且可以用于标准 PCR 或实时荧光定量 PCR。如果使用者进行的是另一个物种的 ChIP，则建议使用者针对 DNA 设计适宜的特异性引物并确定最佳的 PCR 条件。
• 建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度降低非特异性 PCR 产物的风险。
• PCR 引物选择至关重要。应当严格遵循以下标准设计引物：

标准 PCR 方法

1. 根据待分析样品的数量，标记适宜数量的 0.2 ml PCR 管。这些样品应当包括 2% 样品输入对照、阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照 Normal Rabbit IgG 样品，和未加入 DNA 的试管以排除 DNA 污染。
2. 向每支管中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物，配置时多配置两个样本的试剂以弥补分管时的体积损耗。向每支反应管中添加 18 μl 主混合物。

4. 启动以下 PCR 反应程序：

5. 从每支反应管中取出 10 μl PCR 产物，使其与 100 bp DNA 标准品同时进行 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，以进行分析。人 RPL30 #7014 和小鼠 RPL30 #7015 的 PCR 产物预期大小分别是 161 bp 和159 bp。

实时定量 PCR 方法

1. 标记适当数量、兼容待用 PCR 仪型号的 PCR 管或 PCR 平板。PCR 反应应当包括阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照 Normal Rabbit IgG 样品、监控 DNA 污染的不含 DNA 模板的试管和 2% 输入对照组染色质 DNA 的连续稀释物（未稀释、1:5、1:25、1:125），以生成标准曲线并测定扩增效率。
2. 向 PCR 平板上的每只管或每个孔中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物。额外足量配置两个反应的试剂以弥补分管时的体积损失。向每支 PCR 反应管或每个孔中添加 18 μl 反应混合物。（安全停止）如有必要用铝箔纸盖住平板以避光，并在 4°C 下最多保存 4 小时或在 -20°C 下过夜，直到机器可以使用。

4. 启动以下 PCR 反应程序：

5. 使用实时 PCR 仪的自带软件，分析定量 PCR 结果。或者，可以使用input样品百分数方法和以下所示的公式，手动计算 IP 效率。采用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表述为占总input样品染色质的百分比。

   输入百分比 = 2% x 2^{（C[T] 2% 输入样品 – C[T] IP 样品）}

   C[T] = C_T = PCR 反应的阈周期

九、NG-Sequencing文库构建

用这种试剂盒制备的免疫富集的 DNA 样品可用于 ChIP-seq 。要构建下游 NG 测序用 DNA 文库，请使用与您的下游测序平台相容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。对于 Illumina^® 平台上测序，我们建议使用 DNA Library Prep Kit for Illumina^® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 及其相关索引引物 Multiplex Oligos for Illumina^® (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina^® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538。

建议：

• 对于转录因子或辅因子 ChIP-seq，使用至少 5 ng ChIP 富集的 DNA 和 10 个 PCR 循环扩增衔接子连接的 DNA。
• 对于总组蛋白和组蛋白修饰或样品输入对照，开始时使用至少 50ng ChIP 富集的 DNA 和 6 个 PCR 循环扩增衔接子连接的 DNA。
• 要对全部靶标类型的 ChIP-富集的 DNA 构建文库，需对衔接子连接的 DNA 进行纯化，但无需进行大小选择。
• 在构建 DNA 文库之后，使用 Agilent High Sensitivity DNA Kit （Agilent Technologies，货号：G2938-90322）或通过与 50-100 ng DNA 在 2% 琼脂糖 TAE 凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳，来检验 DNA 文库中衔接子二聚体（约 140 bp）是否存在。如果 DNA 文库中存在衔接子二聚体，则重复 PCR 扩增材料的纯化。
• 也可通过对已知阳性和阴性靶基因座使用 qPCR 和引物组来确认文库的质量。与阴性引物相比，阳性引物对仍然应当产生相同的高信号，如原始 qPCR 分析 ChIP 富集的 DNA 时所见。
• 完成最终的纯化和质量检验后，制备浓度为 2-10 nM 的最终纯化文库样品以用于高通量测序。

附录 A：预期的染色质产量

从组织样品收获交联的染色质时，组织类型之间的染色质产率可能显著不同。右表显示了用 25 mg 组织（类似于 4 x 10⁶ 个 Hela 细胞）制备的染色质预期产率和预期 DNA 浓度的范围，该产率和浓度按实验步骤第四部分的方法测定。对于每种组织类型，使用 Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器离散获得了相似数量的染色质。但是，与用通过 Dounce 匀浆器离散的组织制备和处理的染色质相比，用通过 Medimachine 离散的组织制备和处理的染色质通常具有更高的 IP 效率。强烈推荐 Dounce 匀浆器用于离散脑组织，原因是 Medimachine 无法将脑组织充分分离成单细胞悬液。为了获得最佳的 ChIP 结果，我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 μg 消化的交联染色质，因此，对于某些组织，每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。

附录 B：染色质消化的优化

将交联的染色质 DNA 消化成 150-900 个碱基对长度的最佳条件高度取决于 Micrococcal Nuclease 对消化中所用组织量或细胞数目的比率。以下是确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的实验步骤。

1. 如第一、二和三部分中所述，从125 mg 组织或 2 X 10⁷ 个细胞（等同于 5 份 IP 制备物）制备交联的胞核。在第三部分的步骤 2 之后停止，并如下所述继续。
2. 将 100 μl 胞核制备物转移入 5 个独立的 1.5 ml 微量离心管中，然后置于冰上。
3. 向 27 μl 1X 缓冲液 B + DTT（1:10 酶稀释度）中添加 3 μl Micrococcal Nuclease 原液。
4. 向步骤 2 中 5 支离心管的每支试管中添加 0 μl、2.5 μl、5 μl、7.5 μl 或 10 μl 稀释的 Micrococcal Nuclease，翻转离心管数次进行混合，然后在 37°C 下孵育 20 分钟，同时频繁混合。
5. 添加 10 μl 0.5 M EDTA 并将离心管置于冰上以终止消化。
6. 置于微量离心机中，在 4℃ 下以 16,000 x g 离心 1 分钟，使胞核沉淀，并移除上清液。
7. 将胞核沉淀物用 200 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 重悬。在冰上孵育 10 分钟。
8. 用几个脉冲对裂解物进行声波处理以破坏胞核膜。脉冲间期，将样品置于湿冰上孵育 30 秒。可以通过在光学显微镜下观察声波处理前后的胞核，确定完全裂解胞核所需的最佳条件。通过使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探头的 VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator，Hela 胞核在 3 组 20 秒的脉冲之后完全裂解。或者，可以通过将裂解物置于 Dounce 匀浆器中搅匀 20 次，裂解胞核；但是，裂解可能不完全。
9. 在 4°C 下用微量离心机以 9,400 x g 的离心力离心分离 10 分钟来使裂解物变澄清。
10. 从每份超声处理的裂解物中取出 50 μl 转移至新的微量离心管。
11. 向每份 50 μl 的样品中添加 100 μl 无核酸酶水、6 μl 5 M NaCl 和 2 μl RNAse A。涡旋混合并在 37°C 下孵育 30 分钟。
12. 向每份 RNAse A 消化的样品中添加 2 μl Proteinase K。涡旋混合并在 65°C 下将样品孵育 2 小时。
13. 从每份样品取出 20 μl，使其与 100 bp DNA 标准品在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳以确定 DNA 片段大小。
14. 观察哪个消化条件能够产生所需 150-900 碱基对（1 至 5 个核小体）范围内的 DNA。优化实验步骤中能够获得所需 DNA 片段大小的 Micrococcal Nuclease 的稀释体积等于需添加至一份免疫沉淀制备物（25 mg 离散的组织细胞或 4 X 10⁶ 个组织培养细胞）以获得所需 DNA 片段大小的 Micrococcal Nuclease 原液体积的 10 倍。例如，如果在这个实验步骤中，5 μl 稀释的微球菌核酸酶产生 150-900 碱基对的 DNA 片段，则应当在第 III 部分中染色质消化期间添加 0.5 μl 微球菌核酸酶原液至一份 IP 制备物。
15. 如果结果表明 DNA 的大小未在所需的范围内，则重复优化实验步骤，每次消化中相应调节 Micrococcal Nuclease 的量。或者，可以改变消化时间以提高或降低 DNA 片段化的程度。

附录 C：故障排除指南

染色质免疫沉淀法

特定产品: SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005。

所需的试剂

包括的试剂：

1. Glycine Solution (10X) #7005
2. Buffer A (4X) #7006
3. Buffer B (4X) #7007
4. ChIP Buffer (10X) #7008
5. ChIP Elution Buffer (2X) #7009
6. 5 M NaCl #7010
7. 0.5 M EDTA #7011
8. ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006
9. DNA Binding Buffer #10007
10. DNA Wash Buffer（使用前添加 4x 体积乙醇）#10008
11. DNA Elution Buffer #10009
12. DNA Purification Columns #10010
13. Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012
14. RNAse A (10 mg/ml) #7013
15. Micrococcal Nuclease（2000 凝胶单位/µl）#10011
16. Proteinase K (20 mg/ml) #10012
17. SimpleChIP^® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014
18. SimpleChIP^® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015
19. Histone H3 (D2B12) XP^® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620
20. Normal Rabbit IgG #2729
21. DTT (Dithiothreitol) #7016

未包括的试剂：

1. Magnetic Separation Rack #7017 / 14654
2. Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872
3. Nuclease-free Water #12931
4. 乙醇 (96-100%)
5. 甲醛（37% 母液）
6. Taq DNA 聚合酶
7. dNTP 混合物

I. 组织交联和样品制备

当收获组织时，去除样品上不需要的材料，如脂肪和坏死组织。随后可以立即处理并交联组织，或在干冰上冷冻以待稍后处理。为获得最佳的染色质产率和 ChIP 结果，每次进行免疫沉淀法测试时，使用 25 mg 的组织。不同组织类型的染色质产率也不尽相同，并且一些组织在每次免疫沉淀法测试需要超过 25 mg。有关不同组织类型的预期染色质产率的更多信息，请参见附录 A。额外需要一份染色质样品进行染色质消化和浓度分析（第四部分）。

在开始之前：

• 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) 和 10X Glycine Solution。确保 PIC 完全解冻。
• 对每 25 mg 待处理组织，制备 3 ml 磷酸盐缓冲液 (PBS) + 15μl 200X PIC 并置于冰上。
• 对于每 25 mg 待处理组织，制备 45μl 37% 甲醛并置于室温下贮存。在制造商规定的有效期内使用新鲜甲醛。

A. 交联

1. 称重新鲜或冷冻的组织样品。对于每次要操作的 IP，使用 25 mg 组织。
2. 将组织样品置于 60 mm 或 100 mm 培养皿中并用干净的解剖刀或剃须刀片切碎。将培养皿放在冰上。重要的是将组织置于低温下以防止蛋白质降解。
3. 将切碎的组织转移至 15 ml 锥形试管。
4. 对于每 25 mg 组织，添加 1 ml PBS+ PIC 到锥形试管。
5. 为了使蛋白质与 DNA 交联，向每 1 ml PBS + PIC 中添加 45μl 37% 甲醛并在室温下振摇 20 分钟。甲醛最终浓度是 1.5%。
6. 向每 1 ml PBS + PIC 中添加 100 μl 10X 甘氨酸以终止交联并在室温下混合 5 分钟。
7. 将组织置于台式离心机中，在 4℃ 下以 1,500 转/分钟的速度离心 5 分钟。
8. 移除上清液并用 1 ml PBS+ PIC/25 mg 组织洗涤一次。
9. 置于台式离心机中，在 4℃ 下以 1,500 转/分钟重复离心 5 分钟。
10. 移除上清液，对于每 25 mg 组织，将组织重悬于 1 ml PBS + PIC 中并置于冰上贮存。使用 Medimachine（B 部分）或 Dounce 匀浆器（C 部分），将组织分离成单细胞悬液。

B. 使用 BD Biosciences 的 Medimachine（部件号 340587）离散组织

1. 切去 1000 μL 移液器吸头的末端以扩大开口，用以转移组织块。
2. 将 1 ml 重悬于 PBS + PIC 中的组织转移到 50 mm Medicone（部件号 340592）的顶部室。
3. 根据制造商的说明，研磨组织 2 分钟。
4. 使用 1 ml 注射器和 18 号钝头针，从 Medicone 的底部室收集细胞悬液。将细胞悬液转移至 15 ml 锥形试管并置于冰上。
5. 重复步骤 2 至 4，直到全部组织均处理成均匀悬液。
6. 如果需要更充分地碾磨，则向组织中添加更多的 PBS + PIC。重复步骤 2 至 5，直到全部组织均研磨成均匀悬液。
7. 用显微镜检查单细胞悬液（可选）。
8. 将细胞置于台式离心机中，在 4℃ 下以 1,500 转/分钟离心 5 分钟。
9. 从细胞移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。

C. 使用 Dounce 匀浆器离散组织

1. 将重悬于 PBS + PIC 中的组织转移至 Dounce 匀浆器。
2. 敲击 20-25 次离散组织小片。用显微镜检查单细胞悬液（可选）。
3. 将细胞悬液转移至 15 ml 锥形试管并置于台式离心机中在 4℃ 下以 1,500 转/分钟离心 5 分钟。
4. 从细胞移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。

II. 细胞培养物交联和样品制备

为了获得最佳 ChIP 结果，对于每次将要进行免疫沉淀法测试，使用大约 4 X 10⁶ 个细胞。对于 Hela 细胞，这相当于 15 cm 培养皿所含细胞（在 20 ml 生长培养基中的融合度为 90 %）的一半。要进行染色质消化和浓度分析，应当处理一份额外样品（第四部分）。在实验中额外使用一培养皿的细胞，以便使用血细胞计数器测量细胞数目。

在开始之前

• 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 和 10X Glycine Solution #7005。确保 PIC 完全解冻。
• 对于每个待处理的 15 cm 培养皿，配制 2 ml 磷酸盐缓冲液 (PBS) + 10 μl 200X PIC，并放在冰上。
• 对于每个待处理的 15 cm 培养皿，配制 40 ml PBS，并放在冰上。
• 对于每个待处理的 15 cm 细胞培养皿，配制 540 μl 37% 甲醛，并保存在室温下。在制造商规定的有效期内使用新鲜甲醛。

1. 为让蛋白与 DNA 交联，每个含有 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿添加 540 μl 37% 甲醛。短暂旋转混匀并置于室温下孵育 10 分钟。甲醛的最终浓度是 1%。添加甲醛可能导致培养基颜色发生变化。
2. 每个含 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿添加 2 ml 10X 甘氨酸，稍微涡旋混合，并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能导致培养基颜色发生变化。
3. 对于悬浮细胞，将细胞转移至 50 ml 锥形试管，置于台式离心机中在 4℃ 下以 1,500 转/分钟离心 5 分钟，并用 20 ml 冰冷的 PBS 洗涤沉淀物两次。移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。
4. 对于贴壁细胞，移除培养基和用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞两次，每次都要从培养皿完全移除洗液。
5. 每个 15 cm 培养皿添加 2 ml 冰冷的 PBS + PIC。将细胞刮入冷的缓冲液中。将所有培养皿的细胞混合放入一个 15 ml 锥形试管。
6. 将细胞置于台式离心机中，在 4℃ 下以 1,500 转/分钟离心 5 分钟。移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。

III. 胞核制备和染色质消化

一份免疫沉淀制备物（IP 制备物）是指 25 mg 离散的组织或 4 x 10⁶ 个组织培养细胞。

在开始之前

• 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。使用前确保它完全融化。

• 配制 1 M DTT (192.8 mg DTT #7016 + 1.12 ml dH₂O)。确保 DTT 晶体完全溶解。

  重要提示：一旦溶解，将 1 M DTT 置于 -20℃ 下存放。

• 取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解。
• 对于每份 IP 制备物，制备 1 ml 1X 缓冲液 A（250 μl 4X Buffer A #7006 + 750 μl 水） + 0.5 μl 1M DTT + 5 μl 200X PIC 并置于冰上。
• 对于每份 IP 制备物，制备 1.1 ml 1X 缓冲液 B（275 μl 4X Buffer B #7007 + 825 μl 水） + 0.55 μl 1M DTT 并置于冰上。
• 对于每份 IP 制备物，制备 100 μl 1X ChIP 缓冲液（10 μl 10X ChIP Buffer #7008 + 90 μl 水）+ 0.5 μl 200X PIC 并置于冰上。

1. 对于每份 IP 制备物，将细胞重悬于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 A + DTT + PIC 中。在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟颠倒试管混匀。
2. 置于台式离心机，在 4℃ 下以 3,000 转/分钟离心 5 分钟，使胞核沉淀。对于每份 IP 制备物，移除上清液并将沉淀物重悬于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 B + DTT 中。对于每份 IP 制备物，重复离心，移除上清液并将沉淀物重悬于 100 μl 1X 缓冲液 B + DTT。将样品转移至 1.5 ml 微量离心管，直至每支试管共装有 1 ml 样品。
3. 向每份 IP 制备物中添加 0.5 μl Micrococcal Nuclease #10011，通过翻转离心管数次进行混合并且在 37℃ 下孵育 20 分钟，同时频繁搅拌，以使 DNA 消化成大约 150-900 bp 的长度。每 3 至 5 分钟翻转进行混合。对于各种组织和细胞系（参见附录 B），可能需要通过预实验确定将 DNA 消化成最佳长度所需 Micrococcal Nuclease 的量。用 0.5 μl Micrococcal Nuclease/4 x 10⁶ 个 Hela 细胞消化的胞核和用 0.5 μl Micrococcal Nuclease/25 mg 组织消化的小鼠肝组织产生了适当长度的 DNA 片段。
4. 向每份 IP 制备物中添加 10 μl 0.5 M EDTA #7011 并将离心管置于冰上以终止消化。
5. 置于微量离心机中，在 4℃ 下以 13,000 转/分钟离心 1 分钟，使胞核沉淀，并移除上清液。
6. 对于每份 IP 制备物，将胞核沉淀物重悬于 100 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中并在冰上孵育 10 分钟。
7. 对于每支 1.5 ml 微量离心管，用几个脉冲对至多 500 μl 裂解物进行声波处理，以破坏胞核膜。脉冲间隔将样品置于湿冰上孵育 30 秒。可以通过在光学显微镜下观察声波处理前后的胞核，确定完全裂解胞核所需的最佳条件。通过使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探头的 VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator，Hela 胞核在 3 组 20 秒脉冲之后完全裂解。或者，可以通过将裂解物置于 Dounce 匀浆器中搅匀 20 次，裂解胞核；但是，裂解可能不完全。
8. 通过在微量离心机中在 4℃ 下以 10,000 转/分钟离心 10 分钟，使裂解物变得澄清。
9. 将上清液转移至新试管。该上清液即是交联的染色质制备物，应当置于 -80 ℃ 下贮存直至进一步使用。取出 50 μl 染色质制备物进行染色质消化和浓度分析（第四部分）。

IV. 染色质消化和浓度分析（建议的步骤）

1. 向 50 μl 染色质样品（在第三部分的步骤 9 中制备）中添加 100 μl 无核酸酶水、6 μl 5M NaCl #7010 和 2 μl RNAse A #7013。涡旋混合，并在 37℃ 下孵育样品 30 分钟。
2. 向每份经 RNAse A 消化的样品中添加 2 μl Proteinase K。摇晃混匀并在 65℃ 孵育样品 2 小时。
3. 按第七部分中所述的步骤，使用 DNA 纯化离心柱从样品中纯化 DNA。
4. 在纯化 DNA 后，取出 10 μl 样品并将其与 100 bp DNA 标准品置于 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳以确定 DNA 片段的大小。应当将 DNA 消化成大约 150-900 bp 的长度（1 至 5 个核小体）。
5. 为确定 DNA 浓度，将 2μl 纯化的 DNA 转移至 98 μl 无核酸酶水，以获得 50 倍稀释度并读取 OD₂₆₀ 值。DNA 浓度（以 μg/ml 计）为 OD₂₆₀ x 2,500。最理想的 DNA 浓度应介于 50 和 200 µg/ml 之间。

注意：为了获得最佳的 ChIP 结果，适宜大小和合适浓度的染色质非常关键。染色质过度消化可能会在 PCR 定量时削弱信号。染色质消化不充分可能导致背景信号增加和分辨率降低。向 IP 中添加染色质过少可能导致在 PCR 定量时信号削弱。优化染色质消化的实验步骤可以在附录 B 中找到。

五、染色质免疫沉淀法

为了获得最佳的 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 μg 消化的交联染色质（如第四部分中所测定）。这应当和来自 25 mg 分散的组织或 4 x 10⁶ 个组织培养细胞的单一 100μl IP 制备物大致相等。在添加抗体之前，通常将 100μl 消化的染色质稀释到 400μl 1X ChIP 缓冲液中。但是，如果每次 IP 需要 100 μl 以上的染色质，则交联的染色质制备物不需要按照下述方法进行稀释。可以直接向未稀释的染色质制备物中添加抗体以对染色质复合体进行免疫沉淀测试。

在开始之前

• 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。
• 取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解。
• 融化消化的染色质制备物（在第三部分的步骤 9 中制备）并置于冰上。
• 制备低盐洗液：每次免疫沉淀法需使用 3 ml 1X ChIP 缓冲液（300 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 2.7 ml 水）。在室温下储存直至使用。
• 制备高盐洗液：每次免疫沉淀法使用 1 ml 1X ChIP 缓冲液（100 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 900 µl 水） + 70 µl 5M NaCl #7010 在室温下储存直至使用。

1. 在一支试管中，制备足量的 1X ChIP 缓冲液，以稀释消化的染色质，达到免疫沉淀所需的数量：每次免疫沉淀法需使用 400 µl 的 1X ChIP 缓冲液（40 µl 的 10X ChIP 缓冲液 + 360 µl 水）+ 2 µl 200X PIC。当确定免疫沉淀次数时，记得纳入阳性对照样品 Histone H3 (D2B12) XP^® Rabbit mAb #4620 和阴性对照样品 Normal Rabbit IgG Antibody #2729。将混合物置于冰上。
2. 对于每次免疫沉淀，向配置的 1X ChIP 缓冲液中添加 100 μl（5 至 10 μg 染色质）等量的消化的交联染色质制备物（在第三部分中的步骤 9 中制备）。例如，要进行 10 次免疫沉淀，需要准备一支含有 4 ml 1X ChIP 缓冲液（400 μl 10X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 μl 200X PIC + 1 ml 消化的染色质制备物的试管。
3. 取出 10 μl 稀释的染色质样品并将其转移至微量离心管。这将作为 2% 样品输入对照，该样品在后续使用之前可以置于 -20℃ 下贮存（第六部分的步骤 1 ）。
4. 对于每次免疫沉淀，将 500 μl 稀释的染色质转移至 1.5 ml 微量离心管并添加免疫沉淀抗体。每次 IP 需要的抗体量不定而且应当由使用者确定。对于阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP^® Rabbit mAb #4620，向 IP 样品中添加 10 μl。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729，向 IP 样品中添加 1μl (1 μg) 至 2 μl (2 μg)。将 IP 样品在 4℃ 下转动孵育 4 小时至过夜。

注意：Cell Signaling Technology 抗体在每份处于 1 和 2 ug 之间 IP 样品会取得最佳效果。当存在多份不同浓度的样品时，最好使阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。

5. 轻轻涡旋混合，重悬 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006。立即向每 IP 反应中添加 30 μl Protein G Magnetic Beads 并在 4°C 下转动孵育 2 小时。
6. 将试管置于 Magnetic Separation Rack #7017 上，使每次免疫沉淀中的 Protein G Magnetic Beads 沉淀。等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清，然后小心地移除上清液。
7. 向微珠中添加 1 ml 低盐洗液，对 Protein G Magnetic Beads 进行洗涤，然后在 4°C 下转动孵育 5 分钟。再重复步骤 6 和 7 两次，以确保总共进行 3 次低盐洗涤。
8. 向微珠中添加 1 ml 高盐洗液并且在 4℃ 下转动孵育 5 分钟。
9. 将试管置于 Magnetic Separation Rack 上，使每次免疫沉淀中的 Protein G Magnetic Beads 沉淀。等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清，然后小心地移除上清液。立即进入第六部分。

VI. 将染色质从抗体/Protein G Magnetic Beads 上洗脱下来并解交联

在开始之前

• 取出 2X ChIP Elution Buffer #7009 并置于 37℃ 水浴中加热，并确保 SDS 溶解。
• 将水浴或热混合仪设为 65℃。
• 对于每次免疫沉淀和 2% 样品输入对照，制备 150μl 1X ChIP 洗脱缓冲液（75 μl 2X ChIP Elution Buffer #7009 + 75 μl 水）。

1. 向 2% 样品输入对照管中添加 150 μl 1X ChIP 洗脱缓冲液并置于室温下直至开始进行步骤 6。
2. 向每份 IP 样品中添加 150 μl 1X ChIP 洗脱缓冲液。
3. 轻轻涡旋混合（1,200 转/分钟）并在 65°C 下孵育 30 分钟以将染色质从抗体/Protein G Magnetic Beads 上洗脱下来。对于这个步骤，热混合仪效果最佳。或者，可以在室温下转动洗脱，但是可能不会完全洗脱。
4. 将试管置于磁性分离架中使 Protein G Magnetic Beads 沉淀，然后等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清。
5. 小心地将洗脱下来的染色质上清液转移至新试管。
6. 向所有试管（包括步骤 1 中的 2% 输入样品）中添加 6 μl 5M NaCl 和 2 μl Proteinase K #10012 解交联，并在 65 °C 下孵育 2 小时。这次孵育可以延长过夜。
7. 立即进入第七部分。或者，样品可在 -20℃ 下贮存。然而，为了避免形成沉淀物，确保在添加 DNA Binding Buffer #10007 之前，将样品加热到室温（第七部分，步骤 1）。

VII. 使用离心柱纯化 DNA

在开始之前

• 使用前向 DNA Wash Buffer #10008 中添加 24 ml 乙醇 (96-100%)。此操作仅需在第一次DNA纯化前进行。
• 对于第五部分制备的每份 DNA 样品，取出一支 DNA 纯化收集管 #10010。

1. 向每份 DNA 样品中添加 750 μl DNA Binding Buffer #10007 并短暂涡旋混合。
   • 对于每 1 体积样品，应当使用 5 倍体积的 DNA 结合缓冲液。
2. 从在步骤 1 中制备的每份样品中取出 450 μl 并将其至收集管的 DNA 离心柱中。
3. 于微量离心机中以 14,000 转/分钟离心 30 秒。
4. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
5. 从在步骤 1 中制备的每份样品中取出剩余的 450 μl 并将其转移至收集管的离心柱中。重复步骤 3 和 4。
6. 向收集管的离心柱中添加 750 μl DNA Wash Buffer #10008。
7. 于微量离心机中以 14,000 转/分钟离心 30 秒。
8. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
9. 于微量离心机中以 14,000 转/分钟离心 30 秒。
10. 丢弃收集管和液体。保留离心柱。
11. 向每个离心柱中添加 50 μl DNA Elution Buffer #10009 并将其置于洁净的 1.5 ml 微量离心管中。
12. 于微量离心机中以 14,000 转/分钟离心 30 秒，以洗脱 DNA。
13. 取出并丢弃 DNA 离心柱。洗脱物即纯化的 DNA。样品可在 -20℃ 下贮存。

八、用 PCR 定量 DNA

建议

• 使用带滤嘴的移液器吸头，从而最大限度地减少污染风险。
• 试剂盒中所含的对照引物专门用于人或小鼠 RPL30 基因（#7014 + #7015）并且可以用于标准 PCR 或实时荧光定量 PCR。如果使用者进行的是另一个物种的 ChIP，则建议使用者针对 DNA 设计适宜的特异性引物并确定最佳的 PCR 条件。
• 建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度降低非特异性 PCR 产物的风险。
• PCR 引物选择至关重要。应当严格遵循以下标准设计引物：

标准 PCR 方法

1. 根据待分析样品的数量，标记适宜数量的 0.2 ml PCR 管。这些样品应当包括 2% 样品输入对照、阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照 Normal Rabbit IgG 样品，和未加入 DNA 的试管以排除 DNA 污染。
2. 向每支管中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物，配置时多配置两个样本的试剂以弥补分管时的体积损耗。向每支反应管中添加 18 μl 主混合物。

4. 启动以下 PCR 反应程序：

5. 从每支反应管中取出 10 μl PCR 产物，使其与 100 bp DNA 标准品同时进行 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，以进行分析。人 RPL30 #7014 和小鼠 RPL30 #7015 的 PCR 产物预期大小分别是 161 bp 和159 bp。

实时定量 PCR 方法

1. 标记适当数量、兼容待用 PCR 仪型号的 PCR 管或 PCR 平板。PCR 反应应当包括阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照 Normal Rabbit IgG 样品、监控 DNA 污染的不含 DNA 模板的试管和 2% 输入对照组染色质 DNA 的连续稀释物（未稀释、1:5、1:25、1:125），以生成标准曲线并测定扩增效率。
2. 向 PCR 平板上的每只管或每个孔中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物。额外足量配置两个反应的试剂以弥补分管时的体积损失。向每支 PCR 反应管或每个孔中添加 18 μl 反应混合物。

4. 启动以下 PCR 反应程序：

5. 使用实时 PCR 仪的自带软件，分析定量 PCR 结果。或者，可以使用input样品百分数方法和以下所示的公式，手动计算 IP 效率。采用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表述为占总input样品染色质的百分比。

   输入百分比 = 2% x 2^{（C[T] 2% 输入样品 – C[T] IP 样品）}

   C[T] = C_T = PCR 反应的阈周期

九、NG-Sequencing文库构建

用这种试剂盒制备的免疫富集的 DNA 样品可用于 ChIP-seq 。要构建下游 NG 测序用 DNA 文库，请使用与您的下游测序平台相容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。对于 Illumina^® 平台上测序，我们建议使用 DNA Library Prep Kit for Illumina^® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 及其相关索引引物 Multiplex Oligos for Illumina^® (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina^® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538。

建议：

• 对于转录因子或辅因子 ChIP-seq，使用至少 5 ng ChIP 富集的 DNA 和 10 个 PCR 循环扩增衔接子连接的 DNA。
• 对于总组蛋白和组蛋白修饰或样品输入对照，开始时使用至少 50ng ChIP 富集的 DNA 和 6 个 PCR 循环扩增衔接子连接的 DNA。
• 要对全部靶标类型的 ChIP-富集的 DNA 构建文库，需对衔接子连接的 DNA 进行纯化，但无需进行大小选择。
• 在构建 DNA 文库之后，使用 Agilent High Sensitivity DNA Kit （Agilent Technologies，货号：G2938-90322）或通过与 50-100 ng DNA 在 2% 琼脂糖 TAE 凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳，来检验 DNA 文库中衔接子二聚体（约 140 bp）是否存在。如果 DNA 文库中存在衔接子二聚体，则重复 PCR 扩增材料的纯化。
• 也可通过对已知阳性和阴性靶基因座使用 qPCR 和引物组来确认文库的质量。与阴性引物相比，阳性引物对仍然应当产生相同的高信号，如原始 qPCR 分析 ChIP 富集的 DNA 时所见。
• 完成最终的纯化和质量检验后，制备浓度为 2-10 nM 的最终纯化文库样品以用于高通量测序。

附录 A：预期的染色质产量

从组织样品收获交联的染色质时，组织类型之间的染色质产率可能显著不同。右表显示了用 25 mg 组织（类似于 4 x 10⁶ 个 Hela 细胞）制备的染色质预期产率和预期 DNA 浓度的范围，该产率和浓度按实验步骤第四部分的方法测定。对于每种组织类型，使用 Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器离散获得了相似数量的染色质。但是，与用通过 Dounce 匀浆器离散的组织制备和处理的染色质相比，用通过 Medimachine 离散的组织制备和处理的染色质通常具有更高的 IP 效率。强烈推荐 Dounce 匀浆器用于离散脑组织，原因是 Medimachine 无法将脑组织充分分离成单细胞悬液。为了获得最佳的 ChIP 结果，我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 μg 消化的交联染色质，因此，对于某些组织，每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。

附录 B：染色质消化的优化

将交联的染色质 DNA 消化成 150-900 个碱基对长度的最佳条件高度取决于 Micrococcal Nuclease 对消化中所用组织量或细胞数目的比率。以下是确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的实验步骤。

1. 如第一、二和三部分中所述，从125 mg 组织或 2 X 10⁷ 个细胞（等同于 5 份 IP 制备物）制备交联的胞核。在第三部分的步骤 2 之后停止，并如下所述继续。
2. 将 100 μl 胞核制备物转移入 5 个独立的 1.5 ml 微量离心管中，然后置于冰上。
3. 向 27 μl 1X 缓冲液 B + DTT（1:10 酶稀释度）中添加 3 μl Micrococcal Nuclease 原液。
4. 向步骤 2 中 5 支离心管的每支试管中添加 0 μl、2.5 μl、5 μl、7.5 μl 或 10 μl 稀释的 Micrococcal Nuclease，翻转离心管数次进行混合，然后在 37°C 下孵育 20 分钟，同时频繁混合。
5. 添加 10 μl 0.5 M EDTA 并将离心管置于冰上以终止消化。
6. 置于微量离心机中，在 4℃ 下以 13,000 转/分钟离心 1 分钟，使胞核沉淀，并移除上清液。
7. 将胞核沉淀物用 200 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 重悬。在冰上孵育 10 分钟。
8. 用几个脉冲对裂解物进行声波处理以破坏胞核膜。脉冲间期，将样品置于湿冰上孵育 30 秒。可以通过在光学显微镜下观察声波处理前后的胞核，确定完全裂解胞核所需的最佳条件。通过使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探头的 VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator，Hela 胞核在 3 组 20 秒的脉冲之后完全裂解。或者，可以通过将裂解物置于 Dounce 匀浆器中搅匀 20 次，裂解胞核；但是，裂解可能不完全。
9. 通过在微量离心机中在 4℃ 下以 10,000 转/分钟离心 10 分钟，使裂解物变得澄清。
10. 从每份超声处理的裂解物中取出 50 μl 转移至新的微量离心管。
11. 向每份 50 μl 的样品中添加 100 μl 无核酸酶水、6 μl 5 M NaCl 和 2 μl RNAse A。涡旋混合并在 37°C 下孵育 30 分钟。
12. 向每份 RNAse A 消化的样品中添加 2 μl Proteinase K。涡旋混合并在 65°C 下将样品孵育 2 小时。
13. 从每份样品取出 20 μl，使其与 100 bp DNA 标准品在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳以确定 DNA 片段大小。
14. 观察哪个消化条件能够产生所需 150-900 碱基对（1 至 5 个核小体）范围内的 DNA。优化实验步骤中能够获得所需 DNA 片段大小的 Micrococcal Nuclease 的稀释体积等于需添加至一份免疫沉淀制备物（25 mg 离散的组织细胞或 4 X 10⁶ 个组织培养细胞）以获得所需 DNA 片段大小的 Micrococcal Nuclease 原液体积的 10 倍。例如，如果在此实验步骤中，5 μl 稀释的 Micrococcal Nuclease 产生 150-900 碱基对的 DNA 片段，则应当在第三部分中消化染色质期间向一份 IHC 制备物中添加0.5 μl Micrococcal Nuclease 原液。
15. 如果结果表明 DNA 的大小未在所需的范围内，则重复优化实验步骤，每次消化中相应调节 Micrococcal Nuclease 的量。或者，可以改变消化时间以提高或降低 DNA 片段化的程度。

附录 C：故障排除指南

CUT&RUN 实验步骤

一、细胞和组织制备

对于大多数细胞类型，活细胞可用于 CUT&RUN 检测，以产生强大的组蛋白、转录因子和辅因子富集。对于某些易碎或对刀豆蛋白 A 敏感的细胞类型，稍稍进行细胞固定有助于保护细胞并保持它们完整。此外，如果使用新鲜细胞未观察到明显信号，固定可能有助于促进低丰度和/或弱结合转录因子和辅因子的富集。请注意，细胞的过度固定会抑制 CUT&RUN 检测。

我们的 CUT&RUN 分析适用于广泛的细胞或组织。如实验步骤中定义，一个 CUT&RUN 反应可包含 5,000 至 个 250,000 细胞或 1 至 5 mg 的组织。整个实验步骤中使用的缓冲液体积无需根据每次反应的细胞或组织数量进行调整，只要在此范围内即可。当需要时，缓冲液体积确实需要根据正在执行的反应数量按比例增加。如果可能，我们建议每次反应使用 100,000 个细胞或 1 mg 组织。如果细胞数量有限，我们建议每个反应至少使用 5,000 到 10,000 个细胞进行组蛋白修饰，每个反应至少使用 10,000 到 20,000 个细胞进行转录因子或辅因子。

注意： 推荐用于细胞透化的毛地黄皂苷的量是过量的，应该足以用于大多数细胞系和组织类型的通透。然而，并非所有细胞系和组织对毛地黄皂苷都表现出相同的敏感性。如果您的特定细胞系或组织在推荐的毛地黄皂苷浓度下不起作用，您可以按照附录 A 中提供的实验步骤来优化条件。毛地黄皂苷处理应导致 >90% 的细胞群通透。

A. 活细胞制备

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。

• 取出并温热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 #7012 和 100X 亚精胺 #27287。确保两种物质完全融化。
• 制备 1X 洗涤缓冲液（每种细胞系 2 ml，每个反应或每份input样品额外准备 100 µl）。例如，要制备 2.5 ml 1X 洗涤缓冲液，添加 250 µl 10X 洗涤缓冲液 #31415 + 25 µl 100X 亚精胺 #27287 + 12.5 µl 200X 蛋白酶抑制剂混合物 #7012 + 2212.5 µl Nuclease-free Water #12931。让其平衡到室温，以最大程度减少细胞应激。

  注意： 应在室温下连续进行活细胞（无固定）制备步骤，以尽量减少对细胞的压力。为了尽量减少 DNA 碎片，在重悬过程中避免剧烈涡旋和样品起泡。为 CUT&RUN 制备活细胞时，我们建议在制备细胞之前准备伴刀豆球蛋白 A 珠子（第 II 部分，步骤 1 到 5），以尽量减少细胞在珠子制备过程中停留的时间。活化的珠子可以储存在冰上直到准备使用。

1. 在室温下收集新鲜的细胞培养物，以最大程度减少细胞应激。每个反应收集 5,000 个至 100,000 个细胞，并为 input 样品额外收集 5,000 至 100,000 个细胞。确保包括用于阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 和阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 的反应。

   注：对于贴壁细胞，首先需要使用胰蛋白酶将细胞从培养皿中分离出来，并用至少 3 体积的组织培养基中和。我们不建议从培养皿中刮取细胞，因为这会压迫甚至裂解细胞。应使用血细胞计数器或其他细胞计数器对细胞进行计数，以确保用于实验的细胞数量正确。

2. 将细胞悬液在室温下以 600 x g 离心分离 3 分钟，然后移除液体。

   注：处理低细胞数（<100,000 总细胞）的挑战在于，离心后的细胞颗粒并不总是肉眼可见，因此很容易在洗涤步骤中丢失细胞。因此，当处理低细胞数时，我们建议跳过下面的洗涤步骤 3 到 5。伴刀豆球蛋白 A 珠与细胞的结合耐受结合反应中有 40% 的细胞培养基。因此，在步骤 2 中对细胞悬浮液进行初始离心后，可以去除大部分上清液，每次反应留下 ≤40 µl 细胞培养基。然后在步骤 6 中，向细胞悬液中加入足够的 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC），使每次反应的总体积达到 100 µl。

3. 于室温下用 1 ml 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）中重悬细胞沉淀物，并上下轻轻吹打。
4. 在室温下以 600 x g 离心分离 3 分钟，然后移除液体。
5. 重复步骤 3 和 4 一次，以再次清洗细胞沉淀物。
6. 对于每个反应或 input 样品，添加 100 µl 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC），并轻轻上下摇晃移液管来重悬细胞沉淀物。
7. 将 100 µl 细胞转移到一个新管中，并在 4°C 下储存，直到第五部分。这是 input 样本。

   注意：在随后的实验步骤中，将在 55°C 下孵育 input 样品，因此建议使用一根可封盖的 1.5 ml 试管，以减少孵育过程出现蒸发。

8. 立即进入第二部分。

B. 固定细胞制备

注：固定细胞制备需要以下试剂，不包含在此试剂盒中：37% 甲醛或 16% 无甲醇的甲醛 #12606，甘氨酸溶液 (10X) #7005 和 10% SDS 溶液 #20533。

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。

• 取出并温热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 #7012 和 100X 亚精胺 #27287。确保两种物质完全融化。
• 制备 1X 洗涤缓冲液（每种细胞系 2 ml，每个反应或每份input样品额外准备 100 µl）。例如，要制备 2.5 ml 1X 洗涤缓冲液，添加 250 µl 10X 洗涤缓冲液 #31415 + 25 µl 100X 亚精胺 #27287 + 12.5 µl 200X 蛋白酶抑制剂混合物 #7012 + 2212.5 µl Nuclease-free Water #12931。让其平衡到室温，以最大程度减少细胞应激。
• 每 1 ml 待处理细胞悬液制备 2.7 µl 37% 甲醛或 6.25 µl 16% 无甲醇的甲醛 #12606 并保存在室温下。使用制造商规定的有效期内的新鲜甲醛。

1. 每个抗体/微球菌核酸酶 (MNase) 反应收集 5,000 至 100,000 个细胞，并为 input 样品额外收集 5,000 至 100,000 个细胞。确保包括用于阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 和阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 的反应。

   注释：对于贴壁细胞系，首先需要使用胰蛋白酶将细胞从培养皿中分离出来，并用至少 3 体积的培养基中和。我们不建议从培养皿中刮取细胞，因为这会压迫甚至裂解细胞。应使用血细胞计数器或其他细胞计数器对细胞进行计数，以确保用于实验的细胞数量正确。

2. 每 1 ml 细胞悬液添加 2.7 µl 37% 甲醛或 6.25 µl 16% 无甲醇的甲醛 #12606，以达到 0.1% 甲醛的最终浓度。旋转混匀并置于室温下孵育 2 分钟。
3. 每 1 ml 固定细胞悬液添加 100 µl 甘氨酸溶液 (10X) #7005 以停止交联。旋转混匀并置于室温下孵育 5 分钟。
4. 将细胞悬液在 4°C 下以 3,000 x g 的速度离心 3 分钟并除去液体。立即进入第 5 步。（安全停止）或者，固定的细胞沉淀可以在使用前储存在 -80°C 下长达 6 个月。

   注：处理低细胞数（<100,000 总细胞）的挑战在于，离心后的细胞颗粒并不总是肉眼可见，因此很容易在洗涤步骤中丢失细胞。在这种情况下，我们不建议冷冻细胞沉淀物。此外，当处理这些低细胞数时，我们建议跳过下面的洗涤步骤 5 到 7。伴刀豆球蛋白 A 珠与细胞的结合耐受结合反应中有 40% 的细胞培养基。因此，在步骤 4 中对细胞悬浮液进行初始离心后，可以去除大部分上清液，每次反应留下 ≤40 µl 细胞培养基。然后在步骤 8 中，向细胞悬液中加入足够的 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC），使每次反应的总体积达到 100 µl。

5. 通过上下轻轻吹打，在 1 ml 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）中重悬细胞沉淀物。
6. 在室温下以 3,000 x g 的速度离心分离 3 分钟，然后移除液体。
7. 重复步骤 5 和 6 一次，以再次清洗细胞沉淀物。
8. 对于每个反应或 input 样品，添加 100 µl 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC），并轻轻上下摇晃移液管来重悬细胞沉淀物。
9. 将 100 µl 细胞转移到一个新管中，并在 4°C 下储存，直到第五部分。这是 input 样本。

   注意：在随后的实验步骤中，将在 55°C 下孵育 input 样品，因此建议使用一根可封盖的 1.5 ml 试管，以减少孵育过程出现蒸发。

10. 立即进入第二部分。

C. 组织样品制备

对于大多数组织类型，1 mg 轻微固定的组织（0.1% 甲醛，2 分钟）可以产生强大的组蛋白、转录因子和辅因子富集。富集组蛋白修饰不需要甲醛固定。然而，许多转录因子和辅因子确实需要对组织进行光固定以获得最佳结果。一些低丰度和/或弱结合转录因子和辅助因子可能需要中等固定（0.1% 甲醛，10 分钟）以获得最佳结果。此外，在使用具有挑战的组织类型（如纤维组织）时，中等固定可能会改善结果。请注意，过度固定会抑制 CUT&RUN 检测。固定的组织样本在使用前可以在 -80°C 下冷冻长达 6 个月。

注：为 CUT&RUN 准备新鲜组织（无固定）时，我们建议在制备组织之前制备伴刀豆球蛋白 A 珠（第二部分，步骤 1 到 5），以尽量减少细胞在珠子制备过程中停留的时间。活化的珠子可以储存在冰上直到准备使用。

注：固定组织制备需要以下试剂，不包含在此试剂盒中：37% 甲醛或 16% 无甲醇的甲醛 #12606、磷酸盐缓冲盐水 (PBS) #9872、甘氨酸溶液 (10X) #7005 和 10% SDS 溶液 #20533。

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。

• 取出并温热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 #7012 和 100X 亚精胺 #27287。确保两种物质完全融化。
• 制备 1X 洗涤缓冲液（每种组织类型 3 ml，每个反应或每份 input 样品额外准备 100 µl）。例如，要制备 3.5 ml 1X 洗涤缓冲液，添加 350 µl 10X 洗涤缓冲液 #31415 + 35 µl 100X 亚精胺 #27287 + 17.5 µl 200X 蛋白酶抑制剂混合物 #7012 + 3097.5 µl Nuclease-free Water #12931。让其平衡到室温，以最大程度减少细胞应激。
• 如果需要组织固定，请准备以下缓冲液：
  • 为每种组织类型制备 1 ml 固定缓冲液，方法是通过添加 2.7 µl 37% 甲醛或 6.25 µl 16% 无甲醇的甲醛 #12606 和 5 µl 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012 到 1 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) #9872 中。使用制造商规定的有效期内的新鲜甲醛。
  • 为每种组织类型准备 1 ml PBS #9872 + 5 µl 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012 并置于冰上。
  • 每 1 ml 固定缓冲液制备 100 µl 甘氨酸溶液 (10X) #7005。

1. 为每个抗体/MNase 反应称量 1 mg 新鲜组织，并为 input 样本称量额外的 1 毫克组织。确保包括用于阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 和阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 的反应。

   注意：对于某些转录因子或辅因子，或对于诸如纤维组织之类的困难组织类型，每个反应最多可使用 5 mg 组织而无需按比例放大试剂。

2. 将组织样本放入盘中，并使用干净的手术刀或剃须刀片切碎。将培养皿放在冰上。重要的是将组织置于低温下以防止蛋白质降解。

   注意：我们建议对组织进行稍稍固定，因为这种条件最适合大多数组织类型和蛋白质靶标。但是，如果需要新鲜组织，请跳过步骤 3 到 8 并立即进行步骤 9。

3. 立即将切碎的组织转移到 1 ml 的固定溶液中，并旋转试管以混匀。

   注意：此体积的固定溶液足以容纳多达 50 mg 的组织。如果处理 >50 mg，则在步骤 7 中相应地增加固定溶液和 1X PBS + PIC 溶液。

4. 室温孵育 2 分钟。

   注意：对于困难的组织类型（如纤维组织）或低丰度和/或弱结合转录因子或辅因子，将甲醛固定延长至 10 分钟可能会改善结果。

5. 通过每 1 ml 固定缓冲液添加 100 µl 甘氨酸溶液 (10X) #7005 来停止交联。旋转混匀并置于室温下孵育 5 分钟。
6. 在室温下以 2,000 x g 的速度离心分离 5 分钟，然后移除液体。
7. 用 1 ml 1X PBS + PIC 重悬组织。
8. 在 4°C 下以2,000 x g 的速度离心 5分钟，然后移除液体，继续步骤 9。（安全停止） 或者，固定的组织沉淀物可以在解聚前在 -80°C 下储存长达 6 个月。
9. 将组织重悬在 1 ml 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）中，并将样品转移到 Dounce 匀浆器中。
10. 用 20-25 冲程将组织块分解成单细胞悬浮液，直到观察不到组织块。
11. 将细胞悬液转移到 1.5 ml 管中，并在室温下以 3,000 x g 的速度离心 3 分钟，从细胞中去除上清液。
12. 在 1 ml 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）中重悬细胞沉淀。
13. 将细胞悬液在室温下以 3,000 x g 离心分离 3 分钟，然后移除液体。
14. 重复步骤 12 和 13 一次，以再次清洗细胞沉淀物。
15. 针对每个反应，添加 100 µl 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC），并轻轻上下摇晃移液管来重悬细胞沉淀物。
16. 将 100 µl 细胞转移到一个新管中，并在 4°C 下储存，直到第五部分。这是 input 样本。

    注意：在随后的实验步骤中，将在 55°C 下孵育 input 样品，因此建议使用一根可封盖的 1.5 ml 试管，以减少孵育过程出现蒸发。

17. 立即进入第二部分。

II. 刀豆球蛋白 A 珠子和一抗的结合

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。

• 将 Concanavalin A Bead Activation Buffer 放在冰上。
• 每次反应制备 1 µl 100X 亚精胺 #27287 + 0.5 µl 200X 蛋白酶抑制剂混合物 #7012 + 2.5 µl 洋地黄皂苷溶液 #16359 + 96 µl 抗体接合缓冲液 #15338，并放在冰上（每次反应 100 µl）。

1. 通过轻轻上下吹打小心地重悬 Concanavalin A 磁珠，确保不要将任何磁珠悬浮液溅出试管。按照每个 CUT&RUN 反应，将 10 µl 珠子悬液转移到一个新的 1.5 ml 微量离心管中。

   注意：避免将伴刀豆球蛋白 A 珠悬浮液涡旋，因为反复涡旋可能会使伴刀豆球蛋白 A 从珠子中移位。

2. 每 10 µl 珠子添加 100 µl Concanavalin A Bead Activation Buffer。上下吸打来轻轻混合珠子。
3. 将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后移除液体。

   注意：为避免珠子丢失，请使用移液管去除液体。请勿使用真空设备抽吸。

4. 从磁力架上取下试管。重复步骤 2 和 3 一次，再次清洗珠子。
5. 添加一体积的 Concanavalin A Bead Activation Buffer，体积等同于初始的重悬珠子的液体体积（每份样品 10 µl），上下吹打重悬。

   注意：如果在细胞或组织制备之前制备伴刀豆球蛋白 A 珠子（如建议用于活细胞和新鲜组织），则活化的珠子可以储存在冰上直至使用。

6. 确保将伴刀豆球蛋白 A 珠充分混合到溶液中。在 I-A 部分步骤 8、I-B 部分步骤 10 或 I-C 部分步骤 17 中制备的洗涤细胞悬浮液中，每次反应添加 10 µl 活化珠悬浮液。
7. 通过上下移液将样品充分混合。室温孵育 5 分钟。

   注意：伴刀豆球蛋白 A 珠子可能会结块或粘附在试管壁上。上下吹打来重悬珠子。

8. 将样品以 100 x g 的速度短暂离心 2 秒，以从管盖上去除细胞：珠子悬浮液。将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒钟至 2 分钟），然后取下试管并丢弃液体。
9. 从支架上取下试管。添加 100 µl 抗体结合缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷），并放在冰上。
10. 按每次反应分装 100 µl 细胞珠子悬液到一根单独的 1.5 ml 试管中，并放在冰上。
11. 按每次反应添加适量抗体，并上下吹打来轻柔混合。

    注意：CUT&RUN 需要的抗体量不定，应由使用者确定。对于阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751，向样品中添加 2 µl 抗体。对于阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control (CUT&RUN) #66362，向样品中添加 5 µl。我们强烈建议使用阴性对照抗体，而不是非抗体对照，因为后者会导致高水平的非特异性 MNase 消化和高背景信号。我们建议尽可能使用 input 样本与 qPCR 和 NG-seq 分析进行比较。

12. 在 4°C 下孵育 2 小时。该步骤可以延长到过夜。

    注意：伴刀豆球蛋白 A 珠子可能会结块或粘附在试管壁上。上下吹打来重悬珠子。

III. pAG-MNase 酶结合

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。

• 取出洋地黄皂苷溶液 #16359 并将其加热至 90-100°C 达 5 分钟，并确保其完全解冻并处于溶液中。立即将已融化的洋地黄皂苷溶液 #16359 放在冰上。

  注意：洋地黄皂苷溶液 #16359 应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上，并在实验完成后保存在 -20°C 下。

• 按每次反应制备 1.05 ml 洋地黄皂苷缓冲液（105 µl 10X 洗涤缓冲液 #31415 + 10.5 µl 100X 亚精胺 #27287 + 5.25 µl 200X 蛋白酶抑制剂混合物 #7012 + 26.25 µl 洋地黄皂苷溶液#16359 + 903 µl Nuclease-free Water #12931）。
• 对于每次反应，向一根新管中添加 50 µl 洋地黄皂苷缓冲液（如上所述）和 1.5 µl pAG-MNase 酶来制备 pAG-MNase 预混合物。例如，对于 10 次反应，转移 500 µl 洋地黄皂苷缓冲液到一根新管中，并添加 15 µl pAG-MNase 酶。轻轻上下吹打以混合，并放在冰上。

1. 以 100 x g 的速度短暂离心分离第二部分步骤 12 的样品，以去除试管盖上的细胞珠子悬液。2
2. 将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒钟至 2 分钟），然后移除液体。
3. 从磁力架上取下试管，添加 1 ml 洋地黄皂苷缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷）。通过轻轻上下移液重悬珠子，确保收集粘在管壁上的所有珠子。
4. 将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒钟至 2 分钟），然后移除液体。
5. 从磁力架上取下试管。向每根试管添加 50 µl pAG-MNase 预混合物，并轻轻上下吹打来混合样品。
6. 在 4°C 下孵育 1 小时。

   注意：Concanavalin A 磁珠可能会结块或粘附在试管壁上。上下吹打来重悬珠子。

7. 立即进行第四部分。

IV. DNA 消化和释放

开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。

• 取出洋地黄皂苷溶液 #16359 并将其加热至 90-100°C 达 5 分钟，并确保其完全解冻并处于溶液中。立即将已融化的洋地黄皂苷溶液 #16359 放在冰上。

  注意：洋地黄皂苷溶液 #16359 应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上，并在实验完成后保存在 -20°C 下。

• 每次反应制备 2.15 ml 洋地黄皂苷缓冲液（215 µl 10X 洗涤缓冲液 #31415 + 21.5 µl 100X 亚精胺 #27287 + 10.75 µl 200X 蛋白酶抑制剂混合物 #7012 + 53.75 µl 洋地黄皂苷溶液#16359 + 1.849 µl Nuclease-free Water #12931）。
• 将氯化钙放在冰上。
• 如果从第 I 节中的固定材料开始，请确保 10% SDS Solution #20533 完全溶解。加热至 37°C 将有助于溶解 SDS 沉淀物。
• 每次反应制备 150 µl 1X Stop Buffer（37.5 µl Stop Buffer #48105 + 3.75 µl 洋地黄皂苷溶液 #16359 + 0.75 µl 200X RNAse A #7013 + 108 µl Nuclease-free Water #12931）。

  可选：如需对样品进行标准校对，则可将 Sample Normalization Spike-In DNA 添加到 1X Stop Buffer 中（例如，见第七部分的图 8）。对于 qPCR 分析，我们建议每次反应加入 5 µl (5 ng) Spike-In DNA。对于 NG-seq 分析，我们建议用 Nuclease-free Water #12931 稀释 Sample Normalization Spike-In DNA 100 倍，每次反应加入 5 µl (50 pg) Spike-In DNA。当每次反应使用 100,000 个细胞或 1 mg 组织时，这可确保标准化读数约为总测序读数的 0.5%。如果每个反应使用多于或少于 100,000 个的细胞或 1 mg 组织，按比例放大或缩小样本标准化 Spike-In DNA 的体积，以将标准化读数调整到总读数的 0.5% 左右。

1. 以 100 x g 的速度短暂离心分离第三部分步骤 6 的样品，以去除试管盖上的细胞珠子悬液。2
2. 将试管放在磁分离架上，直到溶液变澄清（30 秒钟至 2 分钟），然后移除液体。
3. 从磁分离架上取下试管。添加 1 ml 洋地黄皂苷缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷），并轻轻上下吹打来重悬珠子。
4. 重复步骤 2 和 3 一次。
5. 将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒钟至 2 分钟），然后移除液体。
6. 从磁力架上取下试管。往每根试管中添加 150 µl 洋地黄皂苷缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷），并轻轻上下摇晃移液管来混合。
7. 将试管在冰上放置 5 分钟，使之在消化反应前冷却。
8. 向每根试管中添加 3 µl 冷却的氯化钙来激活 pAG-MNase，并上下吹打混合。
9. 4°C 条件下孵育样本 30 分钟。

   注意：应在 4°C 的冷却块或冰箱中进行消化。冰的温度可低至 0°C，这可能会限制消化并降低信号。

10. 向每份样品中添加 150 µl 1X Stop Buffer（+ 洋地黄皂苷 + RNAse A + Spike-in DNA [可选]），并上下吹打来混合。
11. 在 37°C 下孵育试管 10 分钟，不要摇晃，使 DNA 片段进入溶液。
12. 以 16,000 x g 在 4°C 下离心分离 2 分钟，然后将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒钟至 2 分钟）。
13. 将上清液转移到一根新的 2 ml 微量离心管中。 这些是富含染色质的样品。

    注意：如果使用活细胞或新鲜组织（未固定）进行 CUT&RUN 测定，跳过步骤 14-15，然后立即进行步骤 16。

    注意：在随后的实验步骤中，将在 65°C 下孵育 input 样品，因此建议使用一根可封盖的 2 ml 试管，以减少孵育过程出现蒸发。

14. 要逆转固定细胞或组织样品中的交联，让样品升温至室温并添加 3 µl 10% SDS 溶液 #20533（0.1% 终浓度）和 2 µl 蛋白酶 K (20 mg/ml) #10012 到每个样品。

    注意：如果样品没有预热到室温，SDS 可能会从溶液中沉淀出来。

15. 涡旋混合每个样品并在 65℃ 下孵育样品 2 小时。 这次孵育可以延长过夜。孵育后，以 10,000 x g 的速度快速旋转样品 1 秒，以收集管盖的蒸发。
16. 将样品平衡至室温并进行第 VI 部分。（安全停止）或者，可将样品保存在 -20°C 下， 1 周以内。但在 DNA 纯化（第 VI 部分）之前，请确保将样品加热到室温。

V. Input 样品的制备

输入 DNA 的片段化是与下游 NG 测序兼容所必需的，但对于下游 qPCR 分析则不是必需的。如果没有超声波仪，我们建议使用未片段化的输入 DNA 进行 qPCR 分析；然而，输入 DNA 应使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化，因为未片段化输入 DNA 的尺寸太大而无法使用 DNA 离心柱进行纯化。如果没有超声波仪并且需要进行下游 NG 测序分析，则可以使用 CUT&RUN 正常 IgG 抗体样品作为阴性对照，尽管这并不理想，因为正常的富含 IgG 的样品可能会显示非特异性 DNA 富集。或者，使用 MNase 的输入 DNA 片段化实验步骤可在 https://cst-science.com/CUT-RUN-input-digestion 获得。

! 所有缓冲液的体积都应根据正在制备的input样品的数量按比例增加。

开始之前：

• 取出并加热 DNA 提取缓冲液 #42015。确保完全解冻。
• 每份 input 样品制备 2 µl 蛋白酶 K #10012 + 0.5 µl RNAse A #7013 + 197.5 µl DNA 的提取缓冲液 #42015（每份 input 样品共 200 µl）。

1. 将 200 µl DNA 提取缓冲液（+ 蛋白酶 K + RNAse A）添加到 100 µl input 样品中，这些样品来自 I-A 部分步骤 7、I-B 部分步骤 9 或 I-C 部分步骤 16。上下吹打混合。
2. 将试管放在 55°C 下 1 小时，伴有摇晃。
3. 将试管放在冰上 5 分钟，让样品完全冷却。
4. 对input样品进行超声处理，以裂解细胞并破碎染色质。在两次脉冲之间将样品放在冰上孵育 30 秒钟。

   注意：超声处理条件可能需要根据 附录 B 中的步骤通过测试不同的超声仪功率设置和/或超声处理持续时间来凭经验确定。最佳超声处理条件将产生大小从 100-600 bp 不等的染色质片段。使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探针的 VirTis Virsonic 100 超声波均质器/超声波仪以 5 组 15 秒脉冲进行超声处理，可充分碎裂input染色质。

5. 在 4°C 下以 18,500 x g 离心分离 10 分钟来使裂解物变澄清。将上清液转移到一根新的 2 ml 微量离心管。
6. 立即进行第六部分“DNA 纯化”。（安全停止）或者，可将样品保存在 -20°C 下， 1 周以内。但在 DNA 纯化程序（第 VI 部分）之前，确保将样品加热到室温。

VI. DNA 纯化

如 VI - A 部分所述，使用 DNA 离心柱可从input和富集染色质样品中纯化 DNA，或如第 VI - B 部分所述，使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法进行纯化。使用 DNA 离心柱纯化简单快速，可很好地回收 35 bp 以上的 DNA 片段（图 7A，泳道 2）。苯酚/氯仿提取之后再行乙醇沉淀更加困难，但能很好地回收 35 bp 以下的 DNA 片段（图 7A，泳道 3）；但如图 7B 所示，大多数在 CUT&RUN 检测中产生的 DNA 片段大于 35 bp。因此，DNA 离心柱提供一种快速简单的方法来纯化 > 98% 的所有 CUT&RUN DNA 片段。

在 NG-seq 分析之前，使用基于 picogreen 的 DNA 定量测定法可以对纯化的 DNA 进行定量。对于含 100,000 个细胞的 CUT&RUN 反应，一次转录因子和辅因子的 CUT&RUN 反应中，预期 DNA 产量为 0.5-10 ng，而在一次组蛋白修饰反应中则为 1-20 ng。

图 7. 比较使用离心柱或苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法进行的 DNA 纯化。(A) 低量程 DNA 分子量标准（泳道 1，未纯化）使用 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209（泳道 2）进行纯化，或使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法（泳道 3）进行纯化，并在 4% 琼脂糖凝胶电泳来进行分离。如图所示，苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀能有效回收所有大小的 DNA 片段，而 DNA 离心柱仅能回收 ≥ 35 bp 的 DNA 片段。(B) 在使用 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 的 CUT&RUN 检测中使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化 DNA。使用一台Bioanalyzer (Agilent Technologies) 分析文库中 DNA 片段的大小。在构建期间添加到文库中的接头蛋白和条码序列的片段长度为 140 bp。因此，文库制备后，起始 35 bp 的 DNA 片段长度将变为 175 bp（图中用蓝色垂直线标注）。如图所示，总 CUT&RUN 富集 DNA 片段中不到 2% 短于 175 bp（起始长度 35 bp），提示 DNA 纯化离心柱足以捕获 > 98% 的总 CUT&RUN DNA 片段。

A. 使用离心柱进行 DNA 纯化

注意：使用 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209（未包含在本试剂盒中）以及下面修改后的实验步骤从 input 样品和富集染色质样品中纯化 DNA。步骤 1-5 已修改，以符合向 300 µl input样品和富集染色质样品中添加 5 倍体积 (1.5 ml) DNA 结合缓冲液的要求。

在开始之前：

• !! 使用前添加 24 ml 乙醇 (96-100%) 到 DNA Wash Buffer 中。此操作仅需在第一次DNA纯化前进行。
• 针对每份需纯化的富集染色质样品或 input 样品，取出一个 DNA 纯化收集管。

1. 向每份 input 样品和富集染色质样品中添加 1.5 ml DNA 结合缓冲液，并短暂涡旋。

   注意：1 体积样品应使用 5 体积的 DNA 结合缓冲液。

2. 从在步骤 1 中制备的每份样品中取出 600 μl 并将其至收集管的 DNA 离心柱中。
3. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
4. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。将离心柱放回空的收集管。
5. 重复步骤 2-4，直到步骤 1 中的整个样品已经过离心柱旋转。将离心柱放回空的收集管。
6. 向收集管的离心柱添加 750 μl DNA Wash Buffer。
7. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
8. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。将离心柱放回空的收集管。
9. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
10. 丢弃收集管和液体。保留离心柱。
11. 向每根离心柱添加 50 μl DNA 洗脱缓冲液，并放在干净的 1.5 ml 管中。
12. 用微量离心机以 18,500 x g 的离心力离心分离 30 秒，以洗脱 DNA。
13. 取出并丢弃 DNA 离心柱。洗脱物即纯化的 DNA。（安全停止）样本在 -20°C 下最多保存 6 个月。

B. 使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀方法进行 DNA 纯化

注意：以下试剂是苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀所必需的，不包含在本试剂盒中：苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)、氯仿/异戊醇 (24:1)、3M 乙酸钠 (pH 5.2)、20 mg/ml 糖原、100% 乙醇、70% 乙醇和 1X TE 缓冲液或无核酸酶水 #12931。

1. 向每份input样品和富集染色质样品中添加 300 µl 苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)，并涡旋 30 秒钟充分混合。
2. 使用微量离心机以 16,000 x g 的离心力离心 5 分钟来分层。小心地将大部分顶部水层（避开中间层）转移到一个新管中。
3. 向液体样品中添加 300 µl 氯仿/异戊醇 (24:1)，并涡旋 30 秒钟充分混合。
4. 使用微量离心机以 16,000 x g 的离心力离心 5 分钟来分层。小心地将大部分顶部水层（避开中间层）转移到一个新管中。
5. 向每份液体样品中添加 25 µl 3M 乙酸钠 (pH 5.2)、1 µl 20 mg/ml 糖原和 600 µl 100% 乙醇，并涡旋 30 秒钟混合。
6. 样品在 -80°C 下孵育 1 小时或在 -20°C 下孵育过夜来使 DNA 沉淀。
7. 用微量离心机在 4°C 下以 16,000 x g 离心 5 分钟来使 DNA 沉淀。
8. 小心地移除上清液，用 70% 乙醇洗涤沉淀物。
9. 用微量离心机在 4°C 下以 16,000 x g 离心 5 分钟来使 DNA 沉淀。
10. 移除上清液，并风干沉淀物。
11. 在 50 µl 1X TE 缓冲液或无核酸酶水 #12931 中重悬沉淀物。这是纯化的 DNA。（安全停止）样本在 -20°C 下最多保存 6 个月。

VII. 用 qPCR 定量 DNA

建议：

• 试剂盒中包含的Sample Normalization Primer Set 针对酿酒酵母 ACT1 基因，可用于定量Sample Normalization Spike-In酵母 DNA 的信号来进行样品标准化（可选）。
• 试剂盒中包含的额外对照引物专用于人或小鼠 RPL30 基因（#7014 or #7015），可用来对 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 样品进行定量实时 PCR 分析。如果用户对其他物种进行 CUT&RUN，则用户需要为该物种设计相应的对照引物，并确定最佳 PCR 条件。
• PCR 引物选择至关重要。对于 CUT&RUN，PCR 扩增子大小应大约为 60-80 bp 长。引物的最佳熔解温度应设计为 60°C 左右，GC 含量应在 50% 左右。
• 2 µl 纯化的 DNA 足以对组蛋白、转录因子和辅因子的靶基因进行 qPCR 介导的定量。
• 建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度降低非特异性 PCR 产物的风险。
• 使用带滤嘴的移液器吸头，从而最大限度地减少污染风险。

1. 标记适当数量、兼容待用 PCR 仪型号的 PCR 管或 PCR 平板。PCR 反应应包括阳性对照三甲基组蛋白 H3 Lys4 样品、阴性对照兔 IgG 样品、一个检查 DNA 污染的不含 DNA 的试管以及梯度稀释的input DNA（未稀释、1:5、1:25、1:125），以创建标准曲线，确定扩增效率，并对每份免疫富集样品中的 DNA 数量进行定量。

   注意：如果进行样品标准化，仅CUT&RUN 样品使用Sample Normalization Primer Set分析 。input DNA 不包含Normalization Spike-In DNA。

2. 向 PCR 平板上的每只管或每个孔中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物。每次 PCR 反应设置 2-3 次复孔。添加足量试剂来弥补损耗的体积（1-2 次额外反应）。向每支 PCR 反应管或每个孔中添加 18 μl 反应混合物。

4. 启动以下 PCR 反应程序：

5. 使用实时 PCR 仪的自带软件，分析定量 PCR 结果。或者，可以使用input样品百分数方法和以下所示的公式，手动计算 IP 效率。采用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表述为占总input样品染色质的百分比。
• 输入百分比 = 100% x 2^{（C[T] 100% 输入样品 – C[T] IP 样品）}
• C[T] = C_T = PCR 反应的平均循环阈值
6. 对于样品标准化，选择样品标准化引物组 C[T] 值最低的样品作为选定样品（例如下表示例中的样品 1），并使用以下方程式计算其他样品的标准化系数。使用各自标准化系数调整待测引物组的信号。

**qPCR 的标准化系数 = 2^{（C[T] 选定样品 – C[T] 其他样品）}

图 8. 应用添加的Spike-In DNA对 CUT&RUN 信号进行 qPCR 标准化分析。对数量渐减的 HCT116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 （上小图）或 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499（下小图）进行 CUT&RUN 检测。使用 SimpleChIP^® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516、SimpleChIP^® Human β-Actin Promoter Primers #13653、SimpleChIP^® Human Β-Actin 3' UTR Primers #13669 和 SimpleChIP^® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。 每份样品中免疫沉淀 DNA 的数量表示为与 100,000 个细胞的input染色质总量相对应的信号。左图中为非标准化的富集结果。在每次反应中，按照与起始细胞数量成比例的方式添加 Sample Normalization Spike-In DNA。根据每份样品中添加 DNA 所产生的 qPCR 信号差异，将 CUT&RUN 信号标准化为含 100,000 个细胞的样品。右图显示了标准化后的富集。

八、NG-Sequencing文库构建

用这种试剂盒制备的免疫富集 DNA 样品直接兼容 NG-seq。要构建下游 NG-seq DNA 文库，请使用与您的下游测序平台兼容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。对于在 Illumina^® 平台上测序，我们建议按照 CUT&RUN DNA 的实验步骤，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina^® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 和 Multiplex Oligos for Illumina^® (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 #47538 进行测序。

• CUT&RUN 中产生的背景信号很低，因此每份样品 5 百万个读数的测序深度对于组蛋白修饰和转录因子而言通常已经足够了。如果每份样品的测序深度大于 1500 万，则读取的重复率显著增加。如果每份样品的测序深度低于两百万，则信噪比会降低。
• 对于少于 20,000 个起始细胞数，在 NGS 读取中获得较低的映射率或较高的重复率是很常见的。如果发生这种情况，我们建议增加测序深度以获得足够数量的唯一映射读取用于下游数据分析。
• 进行样品标准化时，将所有样品的 CUT&RUN 测序数据比对至测试参照基因组（例如人）和样品标准化酿酒酵母基因组。选择酵母unique reads数最少的样品作为选定样品（例如下表中的样品 1），并使用下方的方程式计算其他样品的标准化系数。使用各自标准化系数来减低与每份样品的测试参考基因组对应的unique reads数。使用缩小的数据集进行进一步的 NGS 分析。

NGS 的标准化系数 = 选定样品的酵母unique reads数/其他样品的酵母unique reads数

附录 A：测试细胞对洋地黄皂苷的敏感性

在 CUT&RUN 实验步骤中，向缓冲液中添加洋地黄皂苷能促进细胞膜透化以及一抗和 pAG-MNase 酶进入细胞和胞核。因此，缓冲液中有足量的洋地黄皂苷对抗体和酶的成功结合以及靶向基因位点的消化至关重要。不同细胞系对洋地黄皂苷细胞透化有不同的敏感性。虽然本实验步骤中建议的洋地黄皂苷量应足以对大多数细胞系或组织进行透化，但您可以使用本实验步骤测试您的特定细胞系或组织。我们发现，添加过量的洋地黄皂苷对本实验没有损害，因此无需生成浓度曲线。所以，进行快速测试以确定建议的洋地黄皂苷量是否适合你的细胞系就足够了。

在开始之前：

• 取出洋地黄皂苷溶液 #16359，并在 90-100°C 下加热 5 分钟。确保完全解冻。立即将已融化的洋地黄皂苷溶液 #16359 放在冰上。

  注意：洋地黄皂苷溶液 #16359 应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上，并在实验完成后保存在 -20°C 下。

• 对于每个细胞或组织样品，准备 100 µl 洗涤缓冲液（10 µl 10X 洗涤缓冲液 #31415 + 90 µl 无核酸酶水 #12931）。此测试无需添加亚精胺或蛋白酶抑制剂。

1. 用一个 1.5 ml 试管收集 10,000 - 100,000 个细胞。对于组织，从 1 mg 组织中收集分解的细胞（第 I-C 部分步骤 1-13）。如果您在 CUT&RUN 实验中使用固定的细胞或组织，请确保以与此测试相同的方式固定细胞或组织。
2. 在室温下以 600 x g 离心分离 3 分钟，然后移除液体。

   注意：如果肉眼看不到细胞沉淀，我们建议在步骤 2 中对细胞悬浮液进行初始离心后，在不干扰细胞沉淀的情况下去除尽可能多的细胞培养基，并对每个反应留下一些细胞培养基。然后在步骤 3 中，向细胞悬液中加入足够的 1X 洗涤缓冲液，使总体积达到 100 µl。

3. 在 100 µl 洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀。
4. 将 2.5 µl 洋地黄皂苷溶液 #16359 添加到每个反应中，并在室温下孵育 10 分钟。
5. 将 10 µl 细胞悬液与 10 µl 0.4% 台盼蓝染料混合。
6. 使用血细胞计数器或细胞计数器计算染色细胞的数量和细胞总数。充分通透会导致 > 90% 的细胞被台盼蓝染色。
7. 如果被台盼蓝染色的细胞不到 90%，则增加洋地黄皂苷缓冲液中添加的洋地黄皂苷溶液 #16359 的量，并重复步骤 1-5，直到 > 90% 的细胞被通透和染色。在第 I - IV 部分中采用上述洋地黄皂苷溶液 #16359 的量。

附录 B：对input样品进行超声处理优化

建议对input DNA 样品进行超声处理，因为 DNA 纯化离心柱只能纯化片段化的基因组 DNA (< 10 kb)。此外，片段化的基因组 DNA (< 1 kb) 可在 NG-seq 分析中用作阴性对照。应优化超声处理，以便input DNA 的长度为 100-600 bp。

我们建议使用input样品进行 NG-seq，因为它能方便且无偏倚的呈现细胞基因组。虽然 IgG 样品也可在 NG-seq 中用作阴性对照，但由于存在非特异性结合，它可能会显示基因组特定区域出现富集。非片段化input DNA 可用于 qPCR 分析。但必须使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化非片段化的 DNA。

在开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在制备的input样品的数量按比例增加。

• 室温下取出并加热 DNA Extraction Buffer #42015，确保其完全融化成溶液。
• 每份 input 样品制备 2.1 ml 1X 洗涤缓冲液（210 µl 10X 洗涤缓冲液 #31415 + 1.89 ml 无核酸酶水#12931），并让其平衡到室温，以最大程度地减少细胞应激。无需向此洗涤缓冲液添加亚精胺或蛋白酶抑制剂混合物 #7012。
• 每份 input 样品制备 2 µl 蛋白酶 K #10012 + 0.5 µl RNAse A #7013，添加到 197.5 µl DNA Extraction Buffer #42015（每份 input 样品 200 µl）中。

1. 在 1.5 ml 试管中，收集与您在 CUT&RUN 实验中用于输入的相同数量的细胞（5,000 到 100,000 细胞），用于测试的每个超声处理条件。对于组织，从用于 CUT&RUN 实验（第 I-C 部分步骤 1-13）输入的相同数量的组织中收集分离的细胞，用于测试的每个超声处理条件。如果您在实验中使用固定的细胞或组织，请确保以与此测试相同的方式固定细胞或组织。
2. 在室温下以 600 x g 离心分离 3 分钟，然后移除液体。

   注意：如果在处理低细胞数（<100,000 个细胞）时肉眼看不到离心后的细胞沉淀，我们建议跳过下面的洗涤步骤 3-5。在步骤 2 中对细胞悬浮液进行初始离心后，在不干扰细胞沉淀的情况下去除尽可能多的细胞培养基，并在每个反应中留下一些细胞培养基。然后在步骤 6 中，将足够的 1X 洗涤缓冲液添加到细胞悬液中，以便在每个被测试的超声处理条件下达到 100 µl 的体积。

3. 轻轻上下吹打，以在 1 ml 1X 洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀物。
4. 在室温下以 600 x g 离心分离 3 分钟，然后移除液体。
5. 重复步骤 3 和 4一次来再次清洗细胞沉淀物。
6. 加入 100 µl 的 1X 洗涤缓冲液，并通过轻轻上下吹打重悬细胞沉淀。
7. 对于每个超声处理的条件，分装 100 µl 细胞悬液到一个新试管中。

   主要：在步骤 9 中，在 55°C 下孵育样品，因此建议使用一个可封盖的 1.5 ml 管子，以减少孵育过程中出现蒸发。

8. 向每份样品添加 200 µl DNA 提取缓冲液（+ 蛋白酶 K + RNAse A），并上下摇晃移液管来混合。
9. 将试管放在 55°C 下 1 小时，保持摇晃混匀试管。
10. 将试管放在冰上 5 分钟，让样品完全冷却。
11. 设定一个以 15 秒脉冲声处理的周期数渐增的时程实验，以确定你的超声波仪的最佳声处理条件。确保在两次脉冲之间将样品放在冰上孵育 30 秒钟。
12. 在 4°C 下用微量离心机以 18,500 x g 的离心力离心分离 10 分钟来使裂解物变澄清。将上清液转移到一根新的 2 ml 微量离心管。
13. 按照第 VI 部分的说明，使用 DNA 纯化离心柱或使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化 DNA 样品。
14. 从离心柱中洗脱 DNA，或在 30 µl 1X TE 缓冲液或无核酸酶水 #12931 中重悬 DNA沉淀物。
15. 通过电泳确定 DNA 片段大小。将 > 15 µl 样品上样到含 100 bp DNA 标准分子marker的 1% 琼脂糖凝胶上。建议使用无染料上样缓冲液（30% 甘油）来更好地观察凝胶上的 弥散DNA 。
16. 选择能产生最佳 DNA 片段大小 (100-600 bp) 的超声处理条件，并用于第 V 部分步骤 4 中的 input 样品制备。如果未达到最佳声处理条件，则增加或减少超声波仪的功率设置或声处理周期数，并重复声处理时程实验。

附录 C：故障排除指南

有关详细的疑难解答指南，请访问 https://cst-science.com/troubleshooting-CUT-RUN