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19526
Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) XP® Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体

Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) XP® Rabbit mAb #19526

引用 (0)
筛选器:
  1. WB
  2. IHC
  3. IF
  4. F
Western Blotting Image 1: Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) XP® Rabbit mAb

使用 Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) XP® 兔单克隆抗体(上图)和 Myc-Tag (71D10) 兔单克隆抗体 #2278(下图)对转染空载 (-) 或转染表达 Cas9(酿脓链球菌)的表达载体的 293T 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。

Immunohistochemistry Image 1: Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) XP® Rabbit mAb

使用 Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) XP® 兔单克隆抗体 对在石蜡包埋的、Nprl2 缺陷型 293 细胞沉淀物(左图,阳性)或未处理的 293 细胞沉淀物(右图,阴性)中表达的 Cas9(酿脓链球菌)进行免疫组织化学分析。通过瞬时转染 Cas9(酿脓链球菌)和 Nprl2 特异性引导序列,敲除 Nprl2 缺陷型细胞中的 Nprl2 表达。293/Nrpl2 -/- 细胞由马萨诸塞州坎布里奇麻省理工学院的 Rachel Wolfson、Lynne Chantranupong 和 David Sabatini 惠赠。

Immunohistochemistry Image 2: Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) XP® Rabbit mAb

使用 Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) XP® 兔单克隆抗体 对在石蜡包埋的 Cas9(酿脓链球菌)转基因小鼠脑细胞(左上图,阳性)和脑(顶部中间)、结肠(右上图)、肝(左下图)、肺(底部中间)和胰腺(右下图)等野生型小鼠组织(阴性)中表达的 Cas9 进行免疫组织化学分析。

Immunofluorescence Image 1: Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) XP® Rabbit mAb

使用 Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) XP® 兔单克隆抗体(绿色)对呈结构性 Cas9(酿脓链球菌)表达的小鼠(左图,阳性)或野生型小鼠(右图,阴性)脑细胞进行共聚焦免疫荧光分析。样本用 ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI #8961(蓝色)封片。

Immunofluorescence Image 1: Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) XP® Rabbit mAb

使用 Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) XP® 兔单克隆抗体(绿色)和 Myc-Tag (9B11) Mouse 单克隆抗体 #2276(红色)对瞬时转染带有 myc 标签的 Cas9(酿脓链球菌)表达载体的 293T 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。绿色和红色信号共定位在合成图像(右下图)中显示为黄色。样本用 ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI #8961(蓝色)封片。

Flow Cytometry Image 1: Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) XP® Rabbit mAb

使用 Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) XP® 兔单克隆抗体(实线)或浓度匹配的兔 (DA1E) 单克隆抗体 IgG XP® 同型对照 #3900(虚线)对未转染(蓝色)或转染 Cas9(酿脓链球菌(绿色)的 293 细胞进行流式细胞分析。抗兔 IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 偶联物) #4412 用作二抗。

购买 # 19526S
产品货号 规格 价格 库存
19526T
20 µl
19526S
100 µl

支持数据

反应性 所有物种
敏感性 转染性
MW (kDa) 150
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫组织化学(石蜡) 1:400
免疫荧光法(冰冻) 1:100
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:100
流式细胞术 1:800

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

免疫组织化学(石蜡)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精(可选)。
  5. 洗涤缓冲液
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液:要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112).
  7. 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  8. 3% 过氧化氢:要制备 100 ml,添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备 4 mL of dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
  11. 底物:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  12. 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐:将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液,并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 使 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中,使用前充分混合。
  12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB,并密切观察,通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

检测试剂/底物兼容性
推荐的
检测试剂
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
兼容的
色原
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632  

注意:使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗,考虑到检测试剂的不同灵敏度。


发布​于 2010 年 2 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:283

免疫荧光法(冷冻组织使用柠檬酸修复)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): ( #9808) 要配制 1L 1X PBS:添加50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O,然后混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  4. 封闭缓冲液:(1X PBS / 5% 常规血清/ 0.3% Triton X-100):要制备 10ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 Normal Goat Serum (#5425) 添加至 9.5ml 1X PBS)并充分混合。搅拌的同时,添加 30 µl Triton X-100。
  5. 抗体稀释缓冲液: (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100):要制备 10ml,添加 30 µl Triton X-100 至 10ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (#9998),并混合。
  6. 建议的荧光染料标记的抗小鼠二抗
  7. 注意:首次使用一抗或荧光物质标记的二抗时,用滴定法检测抗体,以确定哪种稀释度会在最低的背景下为您的样品产生最强的特定信号。
  8. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 样品制备和抗原修复

:对固定冷冻组织应用传统的抗原修复流程可能会导致玻片上释放出多余切片。强烈建议用户使用可提高组织粘性的试剂(如 HistoGrip)来预处理玻片,同时将修复温度降至 70°C。

  1. 对于在 -80°C 下储存的组织:切片前先将其从冷冻柜中取出并在 -20°C 的温度下均衡约 15 分钟。这样可以防止切片在封闭时破裂。
  2. 将组织切成厚度在 6–20 µm 之间的切片,并将其置于带正电荷的载玻片上。
  3. 在 60°C 下,在玻片加热器上烘烤 1 小时(这有助于切片黏附在玻片上)。
  4. 将玻片浸入 1X 柠檬酸修复液中,在微波炉中加热,并让温度维持在大约 70°C 20 分钟。
  5. 在实验台上冷却切片 30 分钟。
  6. 用 1X PBS 稍微漂洗切片。

免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭标本时,按照产品网页实验步骤中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  6. 在用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料标记二抗中,避光室温孵育样本 1-2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ,用盖玻片盖住切片。
  9. 要达到最佳效果,使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2017 年 10 月 

实验步骤编号:1569

免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 甲醇,100%
  4. 封闭缓冲液(1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 Normal Goat Serum (#5425))和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  5. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (9998),并混合。
  6. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗:

  7. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。注意:甲醛有毒性,仅可在通风橱中使用
  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸去固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 甲醇通透步骤:在细胞上覆盖冰冷的 100% 甲醇(使用足够的甲醇完全覆盖至 3–5 mm,不要让其干燥),并在 –20°C 下用甲醇孵育 10 分钟,同时用 1X PBS 漂洗 5 分钟。
  2. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  3. 封闭时,按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  4. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  5. 4°C 温度下孵育过夜
  6. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  7. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  8. 按步骤 6 使用 1X PBS 漂洗。
  9. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
  10. 为达到最佳效果,立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2010 年 12 月

实验步骤编号:32

针对兔抗体的甲醇通透实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液和试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS):要制备 1 L 1X PBS:添加 100 ml 10X PBS (#12528) 到 900 ml 水中混合。
  2. 4% 甲醛,不含甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5 % BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。
  5. 建议使用抗兔二抗:
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (PE Conjugate) #79408

注意:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活性染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com,了解经流式细胞术验证的细胞染料完整列表

B. 固定

:固定前,应分离黏附细胞或组织,并放在单细胞悬浮液中。

注意:理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀。

注意:如果使用全血,则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

注意:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中,这类抗体保持结合目的靶标。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 进行离心使细胞沉淀,并去除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物,并阻止个别细胞出现交联。
  3. 在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。继续进行通透步骤。
    1. 或者,细胞可放在 1X PBS 中保存在 4°C 下过夜。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度,以通透细胞。
  2. 在冰上通透至少 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。(通常,每次实验 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心分离,用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,稀释的一抗按建议的稀释度或根据滴定确定用抗体稀释缓冲液制备。
  4. 室温孵育 1 小时。
  5. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗(按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备)中重悬细胞。
  7. 室温孵育 30 分钟。避光保存。
  8. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  9. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:404

特异性/敏感性

Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) 兔单克隆抗体 可检测 Cas9(酿脓链球菌)总蛋白的转染水平。该抗体不会与 Cas9(金黄色葡萄球菌)、FnCpf1 和 AsCpf1 蛋白发生交叉反应。

物种反应性:

预期的所有物种

来源/纯化

使用与 Cas9(酿脓链球菌)蛋白中 Leu833 周围的残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 是一种 RNA 引导的 DNA 核酸酶,并且是 化脓性链球菌 CRISPR 抗病毒免疫系统的组成部分,该系统提供针对外部染色体遗传物质的适应性免疫 (1)。CRISPR 抗病毒作用机制涉及三个步骤:(i) 通过宿主细菌取得外来 DNA;(ii) CRISPR RNA (crRNA) 的合成和成熟,随后形成 RNA-Cas 核酸酶蛋白质复合体;和 (iii) 通过该复合体识别外来 DNA 以及由 Cas 核酸酶活性的剪切作用进行定向干扰 (2)。II 型 CRISPR/Cas 抗病毒免疫系统可提供强有力的基因组精确编辑工具,并且具有特异性调节基因和治疗性应用的潜力 (3)。在细胞中必须引入或表达 Cas9 蛋白和引导 RNA(包含 crRNA 和反式激活 crRNA (tracrRNA) 之间的融合)。引导 RNA 5' 末端的一个 20 核苷酸序列,可以把 Cas9 引导至特定的 DNA 靶标位点。因此,可“编程” Cas9 以便在体外及在细胞和生物中切割多种 DNA 位点。CRISPR/Cas9 基因组编辑工具已经用于许多生物体中,包括小鼠和人类细胞 (4,5)。研究显示,CRISPR 可以用来在啮齿类和灵长类胚胎干细胞中产生突变等位基因或报告基因 (6-8)。

  1. Horvath, P. and Barrangou, R. (2010) Science 327, 167-70.
  2. Wiedenheft, B. et al. (2012) Nature 482, 331-8.
  3. Singh, P. et al. (2015) Genetics 199, 1-15.
  4. Cong, L. et al. (2013) Science 339, 819-23.
  5. Mali, P. et al. (2013) Science 339, 823-6.
  6. Li, D. et al. (2013) Nat Biotechnol 31, 681-3.
  7. Shen, B. et al. (2013) Cell Res 23, 720-3.
  8. Niu, Y. et al. (2014) Cell 156, 836-43.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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