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48989
Cas9 (S. aureus) (6H4) Mouse mAb
一抗
单克隆抗体

Cas9 (S. aureus) (6H4) Mouse mAb #48989

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筛选器:
  1. WB
  2. IP
  3. IF
Western Blotting Image 1: Cas9 (S. aureus) (6H4) Mouse mAb

使用 Cas9 (S. aureus) (6H4) 小鼠单抗(上图)、Myc-Tag (71D10) 兔单抗 #2278(中间)和 β-肌动蛋白 (D6A8) 兔单抗 #8457(下图)对转染空载 (-) 或转染表达带 myc 标签的 Cas9(酿脓链球菌)或 Cas9(金黄色葡萄球菌)(+) 的表达载体的 293T 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。

Immunoprecipitation Image 1: Cas9 (S. aureus) (6H4) Mouse mAb

对转染表达带 myc 标签的 Cas9(金黄色葡萄球菌)的表达载体的 293T 细胞的提取物 Cas9(金黄色葡萄球菌)进行免疫沉淀。泳道 1 为 10% 输入,泳道 2 为小鼠 (E7Q5L) 单抗 IgG2b 同型对照 #53484,泳道 3 为 Cas9 (S. aureus) (6H4) 小鼠单抗。使用 Cas9 (S. aureus) (E4G3U) 兔单抗 #51610 进行蛋白印迹分析。Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074 用作二抗。

Immunofluorescence Image 1: Cas9 (S. aureus) (6H4) Mouse mAb

使用 Cas9 (S. aureus) (6H4) 小鼠单抗(绿色,中间)和 Myc-Tag (71D10) 兔单抗 #2278(红色,右图)对瞬时转染带 myc 标签的 Cas9(金黄色葡萄球菌)表达载体的 HCT 116 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。样本用 ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI #8961(蓝色)封片。重叠信号在合成图像中呈黄色(左图)。

购买 # 48989S
产品货号 规格 价格 库存
48989S
100 µl

支持数据

反应性 所有物种
敏感性 转染性
MW (kDa) 124
来源/亚型 小鼠 IgG2b

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫沉淀 1:200
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:400 - 1:1600

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (#7076)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(#7076,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody(#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育并伴有轻轻摇晃,在室温下孵育 1 小时,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:262

天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于使用 Protein G agarose beads 对天然蛋白进行免疫沉淀,以便之后进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS,将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O 中并混合。
  2. 10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。

    注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

  3. 3X SDS上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。
  4. Protein G Agarose Beads:(#37478)。
  5. 10X 激酶缓冲液(用于激酶测定):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,需将 100 μl 10X 激酶缓冲液添加到 900 μl dH2O 中,然后进行混合。
  6. ATP (10 mM)(用于激酶测定):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 μM),需将10 μl ATP (10 mM) 添加到 490 μl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上进行 3 次超声破碎,每次 5 秒。
  6. 在 4°C,在 14,000 x g 条件下,微量离心 10 分钟,将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清(可选)

  1. 涡旋振荡,以混合磁珠。
  2. 将 10–30 μl 的 50% Protein G agarose bead 混悬液添加到 200 μl 浓度为 1 mg/ml 的细胞裂解物中。
  3. 在 4°C 下,旋转孵育 30–60 分钟。
  4. 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
  5. 继续以下的免疫沉淀法。

免疫沉淀

  1. 将一抗(按产品数据表中的建议进行适当稀释)添加到 200 μl 浓度为 1 mg/ml 的细胞裂解物中。在 4°C 下,旋转孵育过夜。
  2. 添加 Protein G agarose(10–30 μl 的 50% 混悬液)。在 4°C 下,旋转孵育 1-3 小时。
  3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,同时洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活性检测对样品进行分析(D 部分)。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 使用 20 μl 3X SDS 样品缓冲液使沉淀物重新悬浮。涡旋振荡,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 在 SDS-PAGE 的 4–20% 的凝胶上加载样品 (15–30 μl)。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。

注意:为了最大限度减少变性 IgG 重链产生的遮盖作用 (~50 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127

用激酶活性测定法进行分析

  1. 使用 500 μl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 使沉淀物悬浮在添加 40 μM ATP 和适当底物的 200μl 1X 激酶缓冲液中。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 使用 20 μl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 在 SDS-PAGE (4–20%) 上加载样品 (15–30 μl)。

发布​于 2016 年 10 月 

修订于 2018 年 4 月

实验步骤编号:1244

免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液和试剂

若想获得高质量的免疫荧光图片,请使用我们 #12727 Immunofluorescence Application Solutions Kit 中高效且划算的预制试剂。

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭缓冲液:(1X PBS / 5% 常规血清/ 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 Normal Goat Serum (#5425) 添加至 9 ml 1X PBS)并充分混合。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液: (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (#9998),并混合。
  5. 建议使用荧光物质标记的 Anti-Mouse 二抗:

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。

    注意:甲醛有毒性,需在通风橱中使用。

  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时,按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ,用盖玻片盖住切片。
  9. 要达到最佳效果,使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2013 年 11 月

实验步骤编号:148

特异性/敏感性

Cas9 (S. aureus) (6H4) 小鼠单抗 可检测 Cas9(金黄色葡萄球菌)总蛋白的内源水平。该抗体不会与 Cas9(酿脓链球菌)、AsCpf1(菌株 BV3L6)和 FnCpf1(菌株 U112)蛋白发生交叉反应。

物种反应性:

预期的所有物种

来源/纯化

使用对金黄色葡萄球菌 Cas9 蛋白的氨基末端具有特异性的重组蛋白对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 是一种 RNA 引导的 DNA 核酸酶,并且是化脓性链球菌 CRISPR 抗病毒免疫系统的组成部分,该系统提供针对外部染色体遗传物质的适应性免疫 (1)。CRISPR 抗病毒作用机制涉及三个步骤:(i) 通过宿主细菌取得外来 DNA;(ii) CRISPR RNA (crRNA) 的合成和成熟,随后形成 RNA-Cas 核酸酶蛋白质复合体;和 (iii) 通过该复合体识别外来 DNA 以及由 Cas 核酸酶活性的剪切作用进行定向干扰 (2)。II 型 CRISPR/Cas 抗病毒免疫系统可提供强有力的基因组精确编辑工具,并且具有特异性调节基因和治疗性应用的潜力 (3)。在细胞中必须引入或表达 Cas9 蛋白和引导 RNA(包含 crRNA 和反式激活 crRNA (tracrRNA) 之间的融合)。引导 RNA 5' 末端的一个 20 核苷酸序列,可以把 Cas9 引导至特定的 DNA 靶标位点。因此,可“编程” Cas9 以便在体外及在细胞和生物中切割多种 DNA 位点。CRISPR/Cas9 基因组编辑工具已经用于许多生物体中,包括小鼠和人类细胞 (4,5)。研究显示,CRISPR 可以用来在啮齿类和灵长类胚胎干细胞中产生突变等位基因或报告基因 (6-8)。

Cas9(金黄色葡萄球菌) 是一种较小但有效的 Cas9 同源基因,就像更常使用的 Cas9 同源基因 Cas9(酿脓链球菌)一样 (9)。

  1. Horvath, P. and Barrangou, R. (2010) Science 327, 167-70.
  2. Wiedenheft, B. et al. (2012) Nature 482, 331-8.
  3. Singh, P. et al. (2015) Genetics 199, 1-15.
  4. Cong, L. et al. (2013) Science 339, 819-23.
  5. Mali, P. et al. (2013) Science 339, 823-6.
  6. Li, D. et al. (2013) Nat Biotechnol 31, 681-3.
  7. Shen, B. et al. (2013) Cell Res 23, 720-3.
  8. Niu, Y. et al. (2014) Cell 156, 836-43.
  9. Ran, F.A. et al. (2015) Nature 520, 186-91.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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