Calretinin (E7R6O) XP^® Rabbit mAb #92635

蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹，在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween^® 20 中稀释的一抗孵育过夜，同时柔和振摇。

注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测，进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH₂O，混合。
2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH₂O ，混合。
3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH₂O 稀释至 1X。
4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液： 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH₂O ，混合。
5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH₂O 中，并混合。
6. 含有 Tween^® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH₂O 中并混合。
7. 脱脂奶粉：(#9999)。
8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
6. 微量离心机内离心 5 分钟。

7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

   注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm²) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 二甲苯。
2. 无水变性乙醇，组织级（100% 和 95%）。
3. 去离子水 (dH₂O)。
4. 苏木精（可选）。
5. 洗涤缓冲液：
   1. 含 Tween^® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween^® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH₂0 中并混合。
6. SignalStain^® Antibody Diluent (#8112)。
7. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH₂O 中。
8. 3% 过氧化氢：要制备 100 ml，添加 10 ml 30% H₂O₂ 至 90 ml dH₂O 中。
9. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
   1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
   2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备 4 mL of dH₂O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
10. 检测系统：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
11. 底物：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059)。
12. 苏木精： Hematoxylin (#14166)。
13. 封片剂： SignalStain^® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐：将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
6. 去除封闭液，并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain^® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
7. 使 SignalStain^® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
8. 清除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain^® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain^® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain^® DAB Diluent 中，使用前充分混合。
12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain^® DAB，并密切观察，通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
13. 将切片浸入 dH₂O 中。
14. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
15. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
16. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

注意：使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗，考虑到检测试剂的不同灵敏度。

免疫荧光法（冰冻）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
3. 封闭缓冲液：（1X PBS / 5% 常规血清/ 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如 Normal Goat Serum (#5425) 添加至 9.5 ml 1X PBS）并充分混合。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
4. 抗体稀释缓冲液： (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (#9998)，并混合。

5. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗：

   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #8889
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414

   注意：首次使用一抗或荧光物质标记的二抗时，用滴定法检测抗体，以确定哪种稀释度会在最低的背景下为您的样品产生最强的特定信号。

6. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 样品制备 - 冰冻/恒冷箱切片 (IF-F)

1. 冰冻固定组织进行免疫染色（C 部分）。
2. 对新鲜未固定的冰冻组织，请立刻按下列步骤固定：

   1. 切片用 1X PBS 中稀释的 4% 甲醛浸没。

      注意：甲醛有毒性，仅可在通风橱中使用。

   2. 室温下固定切片 15 分钟。
   3. 吸干液体后用 1X PBS 冲洗三次，每次 5 分钟。
   4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭标本时，按照产品网页实验步骤中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
8. 使用 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong^® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
9. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

若想获得高质量的免疫荧光图片，请使用我们 #12727 Immunofluorescence Application Solutions Kit 中高效且划算的预制试剂。

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
3. 封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如 Normal Goat Serum (#5425)）和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH₂O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
4. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (9998)，并混合。

5. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗：

   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #8889
   • Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414
6. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。

   注意：甲醛有毒性，需在通风橱中使用。

2. 室温下固定细胞 15 分钟。
3. 吸干固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
8. 使用 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong^® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
9. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。