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17819
Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体

Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb #17819

引用 (2)
筛选器:
  1. WB
  2. IP
  3. IHC
  4. IF
Western Blotting Image 1: Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb

使用 Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb(上图)和 GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb #5174(下图),对 SNB75、C2C12 和 293T 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。正如预期,293T 细胞表达呈阴性。

Immunoprecipitation Image 1: Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb

对 SNB75 细胞提取物 Calponin 1 进行免疫沉淀。泳道 1 为 10 % input,泳道 2 为 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900,泳道 3 为 Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb。使用 Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb 进行蛋白质印迹分析。

Immunohistochemistry Image 1: Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb

使用 Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人卵巢透明细胞腺癌细胞进行免疫组织化学分析。

Immunohistochemistry Image 2: Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb

使用 Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的 SNB75 细胞沉淀物(左图,阳性)和 MDA-MB-231 细胞沉淀物(右图,阴性)进行免疫组织化学分析。

Immunohistochemistry Image 3: Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb

在有对照肽(左图)或抗原特异性肽(右图)的情况下,使用 Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人结肠浸润性腺癌细胞进行免疫组织化学分析。

Immunohistochemistry Image 4: Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb

使用 Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人前列腺癌细胞进行免疫组织化学分析。

Immunofluorescence Image 1: Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb

使用 Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb (绿色)对小鼠结肠细胞(左图)和骨骼肌细胞(右图)进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。

Immunofluorescence Image 1: Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb

使用 Calponin 1 (D8L2T) XP® Rabbit mAb (绿色)对 SNB75 细胞(左图,阳性)和 MCF10A 细胞(右图,阴性)进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白微丝由 DyLight554™13054 Phalloidin #(红色)进行标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。

购买 # 17819S
产品货号 规格 价格 库存
17819T
20 µl
17819S
100 µl

支持数据

反应性 H M R
敏感性 内源性
MW (kDa) 32
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫沉淀 1:200
免疫组织化学(石蜡) 1:1000
免疫荧光法(冰冻) 1:100
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:100

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

用于蛋白免疫印迹分析的免疫沉淀法

本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法,进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808)。
  2. 10X 细胞裂解缓冲液: (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5),150 mM NaCl,1 mM EDTA,1 mM EGTA,1% Triton X-100,2.5 mM 焦磷酸钠,1 mM β 甘油磷酸酯,1 mM Na3VO4,1 μg/ml 亮抑酶肽

    注意: CST 建议在使用前应添加 1 mM PMSF (#8553)*。

  1. 3X SDS 样品缓冲液: (#7722) 187.5 mM Tris-HCl(pH 6.8,25°C),6% w/v SDS,30% 甘油,150 mM DTT,0.03% w/v 溴酚蓝
  2. 6-Tube Magnetic Separation Rack:(#7017)。
  3. 10X 激酶缓冲液(用于激酶试验):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  4. ATP (10 mM)(用于激酶试验):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM),将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上可对样品进行 3 次超声粉碎,每次 5秒。
  6. 在 4°C,14,000 x g 条件下,离心 10 分钟,将上清转移到新管中。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

  1. 取 200 μl 细胞裂解物并添加 10 µl 固定化抗体,在 4°C 转动孵育过夜
  2. 使用磁力架洗涤沉淀物并将微珠沉淀,待完全澄清后,废弃上清液,添加 500 µl 1X 细胞裂解缓冲液,涡旋混合以重悬及洗涤微珠,继续重复 4 次,共计洗涤 5 次。
  3. 继续使用蛋白质印迹法或激酶活性分析对进行样品分析(D 部分)。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 对于 SDS-PAGE,将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。

注意:为了最大限度减少变性 IgG 重链产生的遮盖作用 (~50 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127

用激酶活性测定法进行分析

  1. 使用磁力架洗涤沉淀物并将微珠沉淀,待完全澄清后,废弃上清液,添加 500 µl 1X 激酶缓冲液,涡旋混合以重悬及洗涤微珠,继续重复 1 次,共计洗涤 2 次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物,并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

发布​于 2007 年 12 月 

实验步骤编号:408

免疫组织化学(石蜡)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精(可选)。
  5. 洗涤缓冲液
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液:要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112).
  7. 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  8. 3% 过氧化氢:要制备 100 ml,添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备 4 mL of dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
  11. 底物:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  12. 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐:将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液,并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 使 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中,使用前充分混合。
  12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB,并密切观察,通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

检测试剂/底物兼容性
推荐的
检测试剂
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
兼容的
色原
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632  

注意:使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗,考虑到检测试剂的不同灵敏度。


发布​于 2010 年 2 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:283

免疫荧光法(冰冻)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭缓冲液:(1X PBS / 5% 常规血清/ 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 Normal Goat Serum (#5425) 添加至 9.5 ml 1X PBS)并充分混合。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液: (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (#9998),并混合。
  5. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗:

    注意:首次使用一抗或荧光物质标记的二抗时,用滴定法检测抗体,以确定哪种稀释度会在最低的背景下为您的样品产生最强的特定信号。

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 样品制备 - 冰冻/恒冷箱切片 (IF-F)

  1. 冰冻固定组织进行免疫染色(C 部分)。
  2. 对新鲜未固定的冰冻组织,请立刻按下列步骤固定:
    1. 切片用 1X PBS 中稀释的 4% 甲醛浸没。

      注意:甲醛有毒性,仅可在通风橱中使用。

    2. 室温下固定切片 15 分钟。
    3. 吸干液体后用 1X PBS 冲洗三次,每次 5 分钟。
    4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭标本时,按照产品网页实验步骤中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ,用盖玻片盖住切片。
  9. 要达到最佳效果,使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2016 年 7 月

实验步骤编号:151

免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液和试剂

若想获得高质量的免疫荧光图片,请使用我们 #12727 Immunofluorescence Application Solutions Kit 中高效且划算的预制试剂。

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭缓冲液(1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 Normal Goat Serum (#5425))和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (9998),并混合。
  5. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗:

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。

    注意:甲醛有毒性,需在通风橱中使用。

  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时,按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ,用盖玻片盖住切片。
  9. 要达到最佳效果,使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2013 年 11 月

实验步骤编号:24

特异性/敏感性

Calponin 1 (D8L2T) Rabbit mAb 可识别内源水平的 Calponin 1 总蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠

来源/纯化

使用与人 Calponin 1 蛋白中 Gly234 周围残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

Calponin 1 是 Calponin 家族的一员,该家族包括 Calponin 1、2 和 3。Calponin 1 在各种组织的平滑肌细胞中高度表达,并与丝状纤丝状肌动蛋白相互作用以调节平滑肌收缩 (1)。

  1. Liu, R. and Jin, J.P. (2016) Gene 585, 143-53.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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