蛋白质印迹法实验步骤
要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。
注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。
A. 溶液和试剂
从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit
注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
- 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
- 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
- 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
- 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
- 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
- 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
- 脱脂奶粉:(#9999)。
- 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
- 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
- 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
- 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
- Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
- Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
- 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
- HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
- 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。
B. 蛋白质印迹
制备样品的常规流程。
- 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
- 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
- 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
- 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
- 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
- 微量离心机内离心 5 分钟。
上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。
- 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。
C. 膜封闭和抗体孵育
注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。
I. 膜封闭
- (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
- 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
- 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
II. 一抗孵育
- 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
- 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
- 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
- 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
- 继续进行检测(D 部分)。
D. 蛋白质检测
使用说明:
- 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
- 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
- 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。
* 避免反复接触皮肤。
发布于 2005 年 6 月
修订于 2020 年 6 月
实验步骤编号:10
免疫组织化学(石蜡)
A. 溶液和试剂
- 二甲苯
- 乙醇,无水变性,组织学分级(100% 和 95%)
- 去离子水 (dH2O)
- Hematoxylin(可选)
- 洗涤缓冲液:
- 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液:要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
- SignalStain® Antibody Diluent (#8112).
- 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
- 3% 过氧化氢:要制备,添加10 ml 30% H2O2至90 ml dH2O 中。
- 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
- TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
- 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备 4 mL of dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
- 检测系统: VECTASTAIN® Elite ABC,包括生物素化二抗 (Vector Laboratories)。
- 底物:Vector® NovaRED™ (Vector Laboratories)。
- 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
- 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。
B. 脱蜡/复水
注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。
- 脱蜡/水化合步骤:
- 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
- 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
- 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
C. 抗原修复
对于柠檬酸盐:将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。
D. 染色
- 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
- 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
- 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
- 在每个切片上滴加 100–400 µl 首选封闭液,在室温下封闭 1 小时。
- 除去封闭液,并给每块切片添加 100-400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 温度下孵育过夜。
- 根据制造商建议说明制备 ABC 溶液。
- 清除一抗,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
- 将每个切片中添加 100-400 µl 生物素化二抗(根据制造商建议在 TBST 中进行稀释)。在室温孵育 30 分钟。
- 清除二抗溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
- 按需使用 100-400 µl 预混合 ABC 溶液覆盖切片,并在湿盒中室温孵育 30 分钟。
- 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
- 根据制造商建议说明制备 Vector® NovaRED™。
- 在每张切片上应用 100–400 µl 底物并密切观察,通常 1-10 分钟即可得到合适的染色强度。
- 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
- 使切片脱水:
- 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
- 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
- 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
- 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。
检测试剂/底物兼容性 |
推荐的 检测试剂 |
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 |
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653 |
兼容的 色原 |
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 |
SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713 |
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632 |
|
注意:使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗,考虑到检测试剂的不同灵敏度。
发布于 2005 年 6 月
修订于 2020 年 6 月
实验步骤编号:303
针对兔抗体的甲醇通透实验步骤(流式细胞术)
A. 溶液和试剂
本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。
注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
- 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS):要制备 1 L 1X PBS:添加 100 ml 10X PBS (#12528) 到 900 ml 水中混合。
- 4% 甲醛,不含甲醇 (#47746)
- 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
- 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5 % BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。
- 建议使用抗兔二抗:
- Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412
- Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889
- Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414
- Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (PE Conjugate) #79408
注意:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活性染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com,了解经流式细胞术验证的细胞染料完整列表。
B. 固定
注:固定前,应分离黏附细胞或组织,并放在单细胞悬浮液中。
注意:理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀。
注意:如果使用全血,则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。
注意:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中,这类抗体保持结合目的靶标。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。
- 进行离心使细胞沉淀,并去除上清液。
- 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物,并阻止个别细胞出现交联。
- 在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。
- 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。继续进行通透步骤。
- 或者,细胞可放在 1X PBS 中保存在 4°C 下过夜。
C. 通透
- 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90% 甲醇的终浓度,以通透细胞。
- 在冰上通透至少 10 分钟。
- 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。
D. 免疫染色
注:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。
- 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。(通常,每次实验 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
- 通过离心分离,用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
- 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,稀释的一抗按建议的稀释度或根据滴定确定用抗体稀释缓冲液制备。
- 室温孵育 1 小时。
- 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
- 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗(按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备)中重悬细胞。
- 室温孵育 30 分钟。避光保存。
- 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
- 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析。
发布于 2009 年 7 月
修订于 2020 年 6 月