免疫组织化学(石蜡)
A. 溶液与试剂
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
- 二甲苯。
- 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
- 去离子水 (dH2O)。
- 苏木精(可选)。
- 洗涤缓冲液:
- 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液:要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
- SignalStain® Antibody Diluent (#8112)。
- 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
- 3% 过氧化氢:要制备 100 ml,添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
- 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
- TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
- 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备 4 mL of dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
- 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Mouse #8125)。
- 底物:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
- 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
- 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。
B. 脱蜡/复水
注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。
- 脱蜡/水化合步骤:
- 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
- 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
- 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
C. 抗原修复
对于柠檬酸盐:将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。
D. 染色
- 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
- 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
- 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
- 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
- 去除封闭液,并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
- 让 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Mouse #8125) 平衡至室温。
- 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
- 按需在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Mouse #8125)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
- 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
- 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中,使用前充分混合。
- 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB,并密切观察,通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
- 将切片浸入 dH2O 中。
- 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
- 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
- 使切片脱水:
- 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
- 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
- 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
- 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。
检测试剂/底物兼容性 |
推荐的 检测试剂 |
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125 |
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Mouse) #31926 |
兼容的 色原 |
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 |
SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713 |
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632 |
SignalStain® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit #12824 |
SignalStain® Deep Black Peroxidase Substrate Kit #72986 |
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SignalStain® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit #69644 |
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注意:使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗,考虑到检测试剂的不同灵敏度。
发布时间 2010 年 2 月
修订时间 2020 年 6 月
实验步骤编号:280
免疫荧光法(免疫细胞化学)
A. 溶液与试剂
注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。
- 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中,混合均匀。调节 pH 至 8.0。
- BrdU(5-溴-2′-脱氧尿苷)EMD biosciences (Cat. #203806)
- 乙醇,变性 70%,溶液,American Bioanalytical (Cat. #CU00844)
- 1.5 M 盐酸
- 封闭缓冲液(1X PBS / 5% 正常血清):
要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(如 Normal Goat Serum (#5425))和 0.5 mL 20X PBS 到 9.0 mL dH2O 中,混合均匀。
- Antibody Dilution Buffer (1X PBS / 1% BSA):添加 0.1 g BSA (#9998) 到 10 ml 1X PBS 中,混合均匀。
建议使用荧光物质标记的 Anti-Mouse 二抗:
- Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。
B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)
注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。
BrdU 掺入:在新鲜预热的生长培养基中稀释 BrdU,至最终浓度为 0.03 mg/mL。向细胞中加入混合物后在 37°C 下孵育 30 分钟。
- 吸干培养基后用冷却的 70% 乙醇完全浸没细胞。
- 室温下固定细胞 5 分钟。
- 吸去固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
- 加入 1.5M HCl 后在室温下孵育 30 分钟。
- 吸去 HCl 后用 1X PBS 洗两次,每次 5 分钟。
- 继续进行免疫染色 C 部分。
C. 免疫染色
注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。
- 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
- 封闭时,按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
- 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
- 4°C 温度下孵育过夜。
- 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
- 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
- 按步骤 5 使用 1X PBS 漂洗。
- 用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071)、Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961) 浸没载玻片或在多孔板上用足够量浸没细胞。
- 为达到最佳效果,立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。
发布时间 2009 年 11 月
修订时间 2010 年 12 月
实验步骤编号:33
流式细胞术
A. 溶液与试剂
- 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS):将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4 溶解在 800 mL 蒸馏水 (dH2O) 中。用 HCl 调整 pH 值至 7.4,使其容量达到 1 升。室温保存。
- BrdU(5-溴-2′-脱氧尿苷)EMD biosciences (Cat. #203806)
- 乙醇,无水变性,组织学级,100% 和 95%
- 1.5M 盐酸
- 孵育缓冲液:将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) 溶解至 100 mL 1X PBS 中。4°C 保存。
- 建议使用 Anti-Mouse 二抗:
B. BrdU 掺入和样本制备
- 在新鲜温热的培养基中加入 BrdU,直至最终浓度为 0.03 mg/mL。搁置在一边。
- 通过离心分离从试管中采集约 5000 万个细胞,并吸干上清液。
- 将 2 ml 含 BrdU 的培养基添加至细胞沉淀物中,涡旋振荡后在 37°C 下孵育 30 分钟。
- 通过离心分离使细胞成团并吸干培养基。
- 将 2 ml 冷却的 70% 乙醇添加至细胞沉淀物中并且混合均匀。
- 室温下固定细胞 5 分钟。
- 加入 2–3 ml PBS,并通过离心分离润洗三次。
- 加入 1.5 M HCL 后在室温下孵育 30 分钟。
- 加入 2–3 ml PBS 后通过离心分离润洗两次。
- 继续进行免疫染色 C 部分。
C. 免疫染色
注意:对于单克隆抗体,使用同型匹配的对照组;对于多克隆抗体,使用物种匹配的 IgG。使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。
- 分装 0.5–1 x 106 细胞到每个测定管中(根据容量)。
- 添加 2-3 ml 孵育缓冲液至每根试管,随后通过离心分离润洗。重复。
- 在每个测试管中加入100 μl 孵育缓冲液重悬细胞。
- 在室温下封闭在孵育缓冲液中 10 分钟。
- 向测试管加入适当稀释度的非偶联的一抗(参阅抗体数据表了解合适的稀释度)。
- 在室温下孵育一小时。
- 按照前述说明,通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
- 在荧光染料标记的二抗中重悬细胞,并按照制造商建议的稀释度在孵育缓冲液中稀释。
- 在室温孵育 30 分钟。
- 按照前述说明,通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
- 在 0.5 ml PBS 中重悬细胞,并用流式细胞分析仪进行分析;或者继续步骤 D1 进行 DNA 染色。
D. 可选的 DNA 染色
- 在 0.5 ml DNA 染料中重悬细胞(如 DRAQ5® #4084)。
- 在室温下孵育至少 5 分钟。
- 用流式细胞分析仪分析 DNA 染色的细胞。
实验步骤编号:30