BrdU (Bu20a) Mouse mAb #5292

免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 二甲苯。
2. 无水变性乙醇，组织级（100% 和 95%）。
3. 去离子水 (dH₂O)。
4. 苏木精（可选）。
5. 洗涤缓冲液：
   1. 含 Tween^® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween^® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH₂0 中并混合。
6. SignalStain^® Antibody Diluent (#8112)。
7. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH₂O 中。
8. 3% 过氧化氢：要制备 100 ml，添加 10 ml 30% H₂O₂ 至 90 ml dH₂O 中。
9. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
   1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
   2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备 4 mL of dH₂O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
10. 检测系统：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Mouse #8125)。
11. 底物：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059)。
12. 苏木精： Hematoxylin (#14166)。
13. 封片剂： SignalStain^® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐：将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
6. 去除封闭液，并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain^® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
7. 让 SignalStain^® Boost Detection Reagent (HRP, Mouse #8125) 平衡至室温。
8. 清除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
9. 按需在切片上滴 1–3 滴 SignalStain^® Boost Detection Reagent (HRP, Mouse #8125)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain^® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain^® DAB Diluent 中，使用前充分混合。
12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain^® DAB，并密切观察，通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
13. 将切片浸入 dH₂O 中。
14. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
15. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
16. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

注意：使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗，考虑到检测试剂的不同灵敏度。

免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液与试剂

注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 中，混合均匀。调节 pH 至 8.0。
2. BrdU（5-溴-2′-脱氧尿苷）EMD biosciences (Cat. #203806)
3. 乙醇，变性 70%，溶液，American Bioanalytical (Cat. #CU00844)
4. 1.5 M 盐酸
5. 封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清）：
   要制备 10 ml，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（如 Normal Goat Serum (#5425)）和 0.5 mL 20X PBS 到 9.0 mL dH₂O 中，混合均匀。
6. Antibody Dilution Buffer (1X PBS / 1% BSA)：添加 0.1 g BSA (#9998) 到 10 ml 1X PBS 中，混合均匀。

7. 建议使用荧光物质标记的 Anti-Mouse 二抗：

   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate)#4408
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate)#4409
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate)#8890
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate)#4410
8. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

BrdU 掺入：在新鲜预热的生长培养基中稀释 BrdU，至最终浓度为 0.03 mg/mL。向细胞中加入混合物后在 37°C 下孵育 30 分钟。

1. 吸干培养基后用冷却的 70% 乙醇完全浸没细胞。
2. 室温下固定细胞 5 分钟。
3. 吸去固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 加入 1.5M HCl 后在室温下孵育 30 分钟。
5. 吸去 HCl 后用 1X PBS 洗两次，每次 5 分钟。
6. 继续进行免疫染色 C 部分。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
4. 4°C 温度下孵育过夜。
5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
6. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
7. 按步骤 5 使用 1X PBS 漂洗。
8. 用 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071)、Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961) 浸没载玻片或在多孔板上用足够量浸没细胞。
9. 为达到最佳效果，立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

流式细胞术

A. 溶液与试剂

1. 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 溶解在 800 mL 蒸馏水 (dH₂O) 中。用 HCl 调整 pH 值至 7.4，使其容量达到 1 升。室温保存。
2. BrdU（5-溴-2′-脱氧尿苷）EMD biosciences (Cat. #203806)
3. 乙醇，无水变性，组织学级，100% 和 95%
4. 1.5M 盐酸
5. 孵育缓冲液：将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) 溶解至 100 mL 1X PBS 中。4°C 保存。
6. 建议使用 Anti-Mouse 二抗：
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate)#4408
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 594 Conjugate)#8890
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate)#4410
   • Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (PE Conjugate)#8887

B. BrdU 掺入和样本制备

1. 在新鲜温热的培养基中加入 BrdU，直至最终浓度为 0.03 mg/mL。搁置在一边。
2. 通过离心分离从试管中采集约 5000 万个细胞，并吸干上清液。
3. 将 2 ml 含 BrdU 的培养基添加至细胞沉淀物中，涡旋振荡后在 37°C 下孵育 30 分钟。
4. 通过离心分离使细胞成团并吸干培养基。
5. 将 2 ml 冷却的 70% 乙醇添加至细胞沉淀物中并且混合均匀。
6. 室温下固定细胞 5 分钟。
7. 加入 2–3 ml PBS，并通过离心分离润洗三次。
8. 加入 1.5 M HCL 后在室温下孵育 30 分钟。
9. 加入 2–3 ml PBS 后通过离心分离润洗两次。
10. 继续进行免疫染色 C 部分。

C. 免疫染色

注意：对于单克隆抗体，使用同型匹配的对照组；对于多克隆抗体，使用物种匹配的 IgG。使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

1. 分装 0.5–1 x 10⁶ 细胞到每个测定管中（根据容量）。
2. 添加 2-3 ml 孵育缓冲液至每根试管，随后通过离心分离润洗。重复。
3. ​在每个测试管中加入100 μl 孵育缓冲液重悬细胞。
4. 在室温下封闭在孵育缓冲液中 10 分钟。
5. 向测试管加入适当稀释度的非偶联的一抗（参阅抗体数据表了解合适的稀释度）。
6. 在室温下孵育一小时。
7. 按照前述说明，通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
8. 在荧光染料标记的二抗中重悬细胞，并按照制造商建议的稀释度在孵育缓冲液中稀释。
9. 在室温孵育 30 分钟。
10. 按照前述说明，通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
11. 在 0.5 ml PBS 中重悬细胞，并用流式细胞分析仪进行分析；或者继续步骤 D1 进行 DNA 染色。

D. 可选的 DNA 染色

1. 在 0.5 ml DNA 染料中重悬细胞（如 DRAQ5^® #4084）。
2. 在室温下孵育至少 5 分钟。
3. 用流式细胞分析仪分析 DNA 染色的细胞。