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3495
Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb
一抗
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Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb #3495

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Western Blotting Image 1: Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb

使用 Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb 对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。

Western Blotting Image 2: Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb

使用 Beclin-1 (D40C5) XP® Rabbit mAb #3495（上）或 α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb #2125（下）对经 100 nM SignalSilence® Control siRNA (Unconjugated) #6568 (-)、SignalSilence® Beclin-1 siRNA I #6222 (+) 或 SignalSilence® Beclin-1 siRNA II (+) 转染的 Hela 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。Beclin-1 (D40C5) XP® Rabbit mAb 可确认 Beclin-1 的表达沉默，而 α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb 则用作观察上样量和 Beclin-1 siRNA 的特异性。

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支持数据

反应性 H M R Mk
敏感性 内源性
MW (kDa) 60
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写：

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫沉淀 1:100

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析，在 4°C 下，将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育，轻晃孵育一整夜。

注意：请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测，蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa)：(#13953)。
  14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#13953，5 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号：10

天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于使用 Protein A agarose beads 对天然蛋白进行免疫沉淀，以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS，将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O 中并混合。

  2. 10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O，并混合。

    注意：使用前，请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

  3. 3X SDS上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。
  4. Protein A Agarose Beads：(#9863)。
  5. 10X 激酶缓冲液（用于激酶试验）：(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  6. ATP (10 mM)（用于激酶试验）：(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM)，将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。
  6. 在 4°C，在 14,000 x g 条件下，微量离心 10 分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清（可选）

  1. 涡旋振荡，以混合磁珠。
  2. 添加 10–30 µl 的 50% Protein A agarose beads 混悬液至 200 µl 细胞裂解物中 (1 mg/ml)。
  3. 在 4°C 下，旋转孵育 30–60 分钟。
  4. 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
  5. 继续以下的免疫沉淀法。

免疫沉淀

  1. 将一抗（按产品说明书中推荐的合适稀释比例配制）加入到浓度为 1 mg/ml 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下，旋转孵育过夜。
  2. 添加 protein A 琼脂糖（10–30 µl 的 50% 珠浆）。在 4°C 下，旋转孵育 1-3 小时。
  3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
  4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活性检测对样品进行分析（D 部分）。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 对于 SDS-PAGE，将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注意：为了最大限度减少变性 IgG 重链产生的遮盖作用 (~50 kDa)，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa)，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）

用激酶活性测定法进行分析

  1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

发布​于 2008 年 12 月 

修订于 2018 年 4 月

实验步骤编号：409

特异性/敏感性

Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb 可检测 Beclin-1 总蛋白的内源水平。

物种反应性：

人, 小鼠, 大鼠, 猴

来源/纯化

使用与人 Beclin-1 蛋白 Thr72 周围的残基相对应的合成肽，对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

自噬是自噬溶酶体降解蛋白质的一种分解代谢过程，由营养剥夺或神经退行性疾病引起 (1)。Beclin-1 是该过程中的关键蛋白之一，是哺乳动物中与酵母自噬蛋白 Apg6/Vps30 同源的基因 (2)。Beclin-1 可以补充由 Apg6 损失而造成的酵母自噬缺陷，在哺乳动物细胞中过表达时，可刺激细胞自噬 (3)。哺乳动物 Beclin-1 最初是从酵母双杂交筛选 Bcl-2 相互作用蛋白中分离出来，并且已经证明可以与 Bcl-2 和 Bcl-xL 相互作用，而不能与 Bax 或 Bak 相互作用 (4)。虽然 Beclin-1 一般普遍表达，但是研究发现在 40-75% 散发人乳腺癌和卵巢癌症中，其单等位基因缺失(5)。Beclin-1 主要位于胞浆结构中，包括线粒体，Beclin-1 过表达会引起核染色和 CRM1 依赖的出核转运 (6)。研究者发现 Beclin-1-/- 小鼠在胚胎发育早期就会死亡，而 Beclin-1-/+ 小鼠则有较高的自发肿瘤发病率。裸小鼠的干细胞的自噬反应改变，而对细胞凋亡的反应则正常 (7)。研究者还发现在体内病毒感染神经元时，Beclin-1 过表达能针对 Sindbis 病毒诱导的疾病和神经元凋亡产生显著保护作用 (4)。

  1. Reggiori, F. and Klionsky, D.J. (2002) Eukaryot. Cell 1, 11-21.
  2. Kametaka, S. et al. (1998) J Biol Chem 273, 22284-91.
  3. Liang, X.H. et al. (1999) Nature 402, 672-6.
  4. Liang, X.H. et al. (1998) J Virol 72, 8586-96.
  5. Aita, V.M. et al. (1999) Genomics 59, 59-65.
  6. Liang, X.H. et al. (2001) Cancer Res 61, 3443-9.
  7. Yue, Z. et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100, 15077-82.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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