反应性 | H M |
灵敏度 | 转染性 |
MW (kDa) | 前体28-成熟12-14。 |
来源/同种型 | 兔 IgG |
产品信息
应用 | 稀释度 |
---|---|
蛋白质印迹法 | 1:1000 |
免疫沉淀法 | 1:50 |
为了进行蛋白质印迹,在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜,同时柔和振摇。
注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。
从样品制备至检测,进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。
注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。
* 避免反复接触皮肤。
发布时间 2005 年 6 月
修订时间 2020 年 6 月
实验步骤编号:10
本实验步骤适用于使用蛋白 A 磁珠分离法对天然蛋白进行免疫沉淀,以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。
注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。
强烈建议进行细胞裂解物预清除步骤,以减少结合 Protein A Magnetic beads 的非特异性蛋白。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。
重要提示:使用前,预先洗涤 #73778 磁珠:
一旦溶液变澄清,便小心清除缓冲液。添加 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液到磁珠沉淀物中,稍微涡旋以洗涤珠子。将试管放回磁分离架。一旦溶液变澄清,便清除缓冲液。再次进行洗涤步骤。
重要提示:最佳裂解物浓度将取决于目的蛋白的表达水平。建议起始浓度为 250 μg/ml-1.0 mg/ml。
重要提示:强烈建议使用相应的同型对照,以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗,把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗,把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗,把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗,把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗,Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。
继续下述其中一项的具体步骤。
注意:为了最大限度减少变性 IgG 重链 (~50 kDa) 产生的遮盖作用,我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP 缀合物 #5127)。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)
发布时间 2008 年 12 月
修订时间 2021 年 4 月
实验步骤编号:410
人, 小鼠
使用与人 BDNF 蛋白的 Gly190 周围残基相对应的合成肽,对动物免疫接种来产生单克隆抗体。
神经营养因子由至少 4 个家族成员(包括 NGF、BDNF、NT-3 和 NT-4)组成,它们已知均影响神经元生长、发育、分化和存活 (1)。前神经营养因子与 p75NTR 结合,但不与 Trk 受体酪氨酸激酶 (Trk) 家族结合,并且BDNF 在成熟后结合并激活 TrkB。Trk 受体反过来会激活三种主要的信号转导通路:(a) 促进神经元分化和神经突增生的 Ras-MAPK 信号转导;(b) 促进神经元存活和生长的 PI3K/Akt 信号转导;以及 (c) 促进突触可塑性的 PLC-γ1-PKC 信号转导 (2)。BDNF 是成体突触传导和可塑性的一个主要调节分子。此外,前体 proBDNF 和成熟蛋白 mBDNF 对长时程增强和长时程抑制产生相反的作用 (3)。BDNF 还与体重调节和活动有关:杂合 BDNF 敲除的小鼠会出现食欲过剩、肥胖和极度活跃 (4)。
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