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15071
Bcl-2 (124) Mouse mAb
一抗
单克隆抗体

Bcl-2 (124) Mouse mAb #15071

引用 (663)
筛选器:
  1. WB
  2. IP
  3. IHC
  4. F
Western Blotting Image 1: Bcl-2 (124) Mouse mAb
使用 Bcl-2 (124) Mouse mAb #15071(上图)或 β-actin (13E5) Rabbit mAb #4970(下图)对对照型 HeLa 细胞 (lane 1) 或 Bcl-2 敲除型 HeLa 细胞 (lane 2) 的提取物进行蛋白印迹分析。Bcl-2 敲除型 HeLa 细胞中没有信号,这证实了该抗体对 Bcl-2 的特异性。
Western Blotting Image 2: Bcl-2 (124) Mouse mAb
使用 Bcl-2 (124) Mouse mAb(上)和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下),对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。KARPAS 细胞系来源:University of Cambridge 的 Abraham Karpas 博士。
Western Blotting Image 1: Bcl-2 (124) Mouse mAb
使用 Bcl-2 (124) Mouse mAb #15071 对 Jurkat 细胞的裂解物 (1 mg/mL) 进行 Simple Western™ 分析。虚拟泳道式图像(左图)显示一抗稀释比例为 1:10 和 1:50 时的靶标条带(如图所示)。对应的电泳图(右图)为一抗稀释比例在 1:10(蓝线)和 1:50(绿线)时沿毛细血管内分子量的化学发光结果。在还原条件下,使用 12-230 kDa 分离模块在 ProteinSimple(BioTechne 品牌)的 Jess™ Simple Western 仪器上进行该实验。

Immunoprecipitation Image 1: Bcl-2 (124) Mouse mAb
使用 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415(泳道 2)或 Bcl-2 (124) Mouse mAb(泳道 3),对 RL 细胞提取物 Bcl-2 进行免疫沉淀分析。泳道 1 是 10% 输入对照。使用 Bcl-2 (D55G8) Rabbit mAb (Human Specific) #4223 进行蛋白质印迹分析。
Immunohistochemistry Image 1: Bcl-2 (124) Mouse mAb
在 Leica® BOND Rx 上使用 Bcl-2 (124) mouse mAb 对石蜡包埋的人乳腺导管癌细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 2: Bcl-2 (124) Mouse mAb
在 Leica® BOND Rx 上使用 Bcl-2 (124) mouse mAb 对石蜡包埋的人非霍奇金氏淋巴瘤进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 3: Bcl-2 (124) Mouse mAb
在 Leica® BOND Rx 上使用 Bcl-2 (124) mouse mAb 对石蜡包埋的人卵巢浆液性癌细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 1: Bcl-2 (124) Mouse mAb
使用 Bcl-2 (124) Mouse mAb 对石蜡包埋的人乳腺癌细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 2: Bcl-2 (124) Mouse mAb
使用 Bcl-2 (124) Mouse mAb 对石蜡包埋的人肺癌细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 3: Bcl-2 (124) Mouse mAb
使用 Bcl-2 (124) Mouse mAb 对石蜡包埋的 RL(阳性,左图)和 HT-29(阴性,右图)细胞沉淀物进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 4: Bcl-2 (124) Mouse mAb
使用 Bcl-2 (124) Mouse mAb 对石蜡包埋的人扁桃体细胞进行免疫组织化学分析。
Flow Cytometry Image 1: Bcl-2 (124) Mouse mAb
使用 Bcl-2 (124) Mouse mAb(实线)或浓度匹配的 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415(虚线)对 HT-29 细胞(蓝色)和 RL 细胞(绿色)进行流式细胞分析。Anti-mouse IgG (H+L),F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4408 作为二抗。
To Purchase # 15071S
目录# 规格 价格 库存
15071T
20 µl
15071S
100 µl

支持性数据

反应性 H
灵敏度 内源性
MW (kDa) 26
来源/同种型 小鼠 IgG1

应用关键词:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
Simple Western™ 1:10 - 1:50
免疫沉淀法 1:50
IHC Leica BOND 1:800 - 1:3200
免疫组织化学(石蜡) 1:400 - 1:1600
流式细胞术(固定/通透) 1:200 - 1:800

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。

有关此产品的无载体蛋白(无 BSA 和无叠氮化物)版本,请参阅产品 #17447

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹,在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜,同时柔和振摇。

注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS:将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O,混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS):(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS:将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ,混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液,配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液: 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ,混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (#7076)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(#7076,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody(#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育并伴有轻轻摇晃,在室温下孵育 1 小时,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:262

天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于使用 Protein G agarose beads 对天然蛋白进行免疫沉淀,以便之后进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 溶液与试剂

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS,将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O 中并混合。
  2. 10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。

    注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

  3. 3X SDS上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。
  4. Protein G Agarose Beads:(#37478)。
  5. 10X 激酶缓冲液(用于激酶测定):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,需将 100 μl 10X 激酶缓冲液添加到 900 μl dH2O 中,然后进行混合。
  6. ATP (10 mM)(用于激酶测定):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 μM),需将10 μl ATP (10 mM) 添加到 490 μl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上进行 3 次超声破碎,每次 5 秒。
  6. 在 4°C,在 14,000 x g 条件下,微量离心 10 分钟,将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清(可选)

  1. 涡旋振荡,以混合磁珠。
  2. 将 10–30 μl 的 50% Protein G agarose bead 混悬液添加到 200 μl 浓度为 1 mg/ml 的细胞裂解物中。
  3. 在 4°C 下,旋转孵育 30–60 分钟。
  4. 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
  5. 继续以下的免疫沉淀法。

免疫沉淀法

重要提示:强烈建议使用相应的同型对照,以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗,把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗,把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗,把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗,把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗,Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。

  1. 将一抗(按产品数据表中的建议进行适当稀释)添加到 200 μl 浓度为 1 mg/ml 的细胞裂解物中。在 4°C 下,旋转孵育过夜。
  2. 添加 Protein G agarose(10–30 μl 的 50% 混悬液)。在 4°C 下,旋转孵育 1-3 小时。
  3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,同时洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活性检测对样品进行分析(D 部分)。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 使用 20 μl 3X SDS 样品缓冲液使沉淀物重新悬浮。涡旋振荡,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 在 SDS-PAGE 的 4–20% 的凝胶上加载样品 (15–30 μl)。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。

注意:当使用兔产生的一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)作为二抗,以尽量减少变性兔子重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白,建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127),以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。

当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗,以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。

用激酶活性测定法进行分析

  1. 使用 500 μl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 使沉淀物悬浮在添加 40 μM ATP 和适当底物的 200μl 1X 激酶缓冲液中。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 使用 20 μl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 在 SDS-PAGE (4–20%) 上加载样品 (15–30 μl)。

发布​时间 2016 年 10 月

修订时间 2021 年 10 月

实验步骤编号:1244

免疫组织化学法 (Leica®BOND™)

:请参阅产品数据表或产品网页,了解合适的抗体稀释度^。

  步骤 试剂 时间/温度
1 脱蜡 BOND™ Dewax Solution、100% 乙醇、BOND™ Wash Solution 预编程的 Leica® BOND™ 
2 抗原修复  BOND™ Epitope Retrieval ER2 Solution 20 分钟,100˚C | 实验步骤:用 ER2 进行 HIER 20 分钟
3 过氧化物封闭液 Polymer Refine Detection Kit Peroxide Block* 5 分钟
  洗涤 BOND™ Wash Solution  3x 0:00 分钟
4 蛋白封闭液(可选) #5425 NGS 或 #15019 Animal-Free Blocking Solution   20 分钟 
5 一抗^ 用 #8112 SignalStain® Antibody Diluent 稀释 30 分钟 
  洗涤 BOND™ Wash Solution  3x 2:00 分钟
6 Post Primary Mouse Linker Polymer Refine Detection Kit Post Primary*  10 分钟 
  洗涤 BOND™ Wash Solution  3x 2:00 分钟
7 二次检测 Polymer Refine Detection Kit Polymer*  10 分钟 
  洗涤 BOND™ Wash Solution/Deionized Water 定制(参见下文)
8a 可视化 Polymer Refine Detection Kit Mixed DAB Refine*  0:00 分钟 
8b 可视化 Polymer Refine Detection Kit Mixed DAB Refine*  10 分钟 
  洗涤 去离子水 3x 0:00 分钟
9 复染 Polymer Refine Detection Kit Hematoxylin*  5 分钟 
  洗涤 去离子水 0:00 分钟 
  洗涤 BOND™ Wash Solution  0:00 分钟 
  洗涤 去离子水 0:00 分钟 
10 脱水(离线):    
  在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。  
  在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。  
  在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。  
11 用盖玻片和 #14177 SignalStain® Mounting Medium 封片。  
       
  可选订制洗涤: BOND™ Wash Solution 2:00
    BOND™ Wash Solution 分配器类型:打开 0:00
    BOND™ Wash Solution 2:00
    BOND™ Wash Solution 分配器类型:打开 0:00
    BOND™ Wash Solution 0:00
    去离子水 0:00

*BOND™ Polymer Refine Detection Kit(货号:DS9800)中所含的试剂

LEICA® 是 Leica Microsystems IR GmbH 的注册商标。

BOND™ 是 Leica Biosystems Melbourne Pty. Ltd 的商标。CST 和 Leica Microsystems IR GmbH 或 Leica Biosystems Melbourne Pty. Ltd 之间没有附属或赞助关系。

发布​时间 2018 年 8 月

修订时间 2018 年 9 月

实验步骤编号:1445

免疫组织化学(石蜡)

A. 溶液与试剂

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精(可选)。
  5. 洗涤缓冲液
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液:要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112)。
  7. 1X EDTA 修复液:要制备 250 mL 的 1X EDTA 修复液,使用 225 mL 的 dH2O 稀释 25 ml 的 SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747)。
  8. 3% 过氧化氢:要制备 100 ml,添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备4 mL 的 dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Mouse #8125)。
  11. 底物:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  12. 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于 EDTA:将切片浸入 1X EDTA 修复液中,再放入微波炉中加热直到沸腾;继续保持 15分钟的亚沸腾温度 (95°-98°C)。无需冷却。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液,并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 让 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Mouse #8125) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 按需在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Mouse #8125)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中,使用前充分混合。
  12. 在每张切片上加 100–400 µl SignalStain® DAB 并密切观察,通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

检测试剂/底物兼容性
推荐的
检测试剂
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Mouse) #31926
兼容的
色原
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632 SignalStain® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit #12824
SignalStain® Deep Black Peroxidase Substrate Kit #72986  
SignalStain® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit #69644  

注意:使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗,考虑到检测试剂的不同灵敏度。


发布​时间 2015 年 2 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:664

针对小鼠抗体的甲醇通透实验步骤 (流式细胞术)

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):若要制备 1 L 1X PBS:将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水,混合。
  2. 4% 甲醛,无甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。
  5. 建议使用 Anti-Mouse 二抗
    • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4408
    • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8890
    • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4410
    • Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (PE Conjugate) #8887

:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活力指示染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品网页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com,了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定

:固定前,贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

:最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

:如果使用全血,则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白质的抗体。在固定和透化过程期间,这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 通过离心使细胞沉淀下来,移除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
  3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
  4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。以 0.5-1 ml 1 X PBS 重悬细胞。继续进行透化步骤。
    1. 或者,细胞可在 1X PBS 中 4°C 保存过夜。

C. 透化

  1. 通过温和涡旋混合的同时,向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度,使细胞透化。
  2. 在冰上透化最短 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞 在 90% 甲醇中 -20°C 保存。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。(通常,每次测定 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心以过量 1X PBS 洗涤分离,以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
  4. 室温孵育 1 小时。
  5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗(按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备)中重悬细胞。
  7. 室温孵育 30 分钟。避光。
  8. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  9. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上分析。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:406

特异性/灵敏度

Bcl-2 (124) Mouse mAb 可识别 Bcl-2 总蛋白的内源水平。

物种反应性:

来源/纯化

使用与人 Bcl-2 蛋白 Gly47 周围残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

在各种凋亡刺激下,Bcl-2 通过抑制线粒体细胞色素 c 的释放而发挥存活功能 (1)。它与线粒体钙稳态和质子流的调节有关 (2)。目前在 Bcl-2 中发现了多个磷酸化位点,包括 Thr56、Ser70、Thr74 和 Ser87 (3)。研究表明,这些磷酸化位点可能是 ASK1/MKK7/JNK1 通路的靶标,并且 Bcl-2 的磷酸化可能是有丝分裂活动的一个标志 (4,5)。在糖皮质激素诱导 T 淋巴细胞凋亡期间,Bcl-2 的 Thr56 或 Ser87 位点突变会抑制其抗凋亡活性 (6)。白介素 3 和 JNK 诱导的 Bcl-2 在 Ser70 位点磷酸化,可能对增强抗凋亡作用至关重要 (7)。

通路

探索与本品相关的通路。

有限使用

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