Bax (2D2) Mouse mAb #89477

蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween^® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育，同时轻轻晃动。

注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测，进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH₂O，混合。
2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH₂O ，混合。
3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH₂O 稀释至 1X。
4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液： 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH₂O ，混合。
5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH₂O 中，并混合。
6. 含有 Tween^® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH₂O 中并混合。
7. 脱脂奶粉：(#9999)。
8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
10. 一抗稀释缓冲液：含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 20 ml，将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
12. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
13. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
14. HRP 偶联二抗：Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (#7076)。
15. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
6. 微量离心机内离心 5 分钟。

7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

   注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm²) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 将膜与 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody（#7076，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody（#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）一起孵育并伴有轻轻摇晃，在室温下孵育 1 小时，再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于使用蛋白 G 磁性分离法对天然蛋白进行免疫沉淀，以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS，将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH₂O 中并混合。

2. 10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH₂O，并混合。

   注意：使用前，请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

3. 3X SDS上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。
4. Protein G Magnetic Beads：(#70024)。
5. 磁分离架：(#7017) 或 (#14654)。
6. 10X 激酶缓冲液（用于激酶试验）：(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH₂O 中并混合。
7. ATP (10 mM)（用于激酶试验）：(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM)，将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5. 在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。
6. 在 4°C，在 14,000 x g 条件下，微量离心 10 分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清（强烈建议）

强烈建议进行细胞裂解物预清除步骤，以减少结合 Protein G Magnetic beads 的非特异性蛋白。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。

1. 稍微涡旋母液试管，以重悬磁珠。

重要提示：使用前，预先洗涤 #70024 磁珠：

2. 转移 20 μl 珠浆到一根干净的试管中。将试管放在磁分离架上 10-15 秒钟。

   一旦溶液变澄清，便小心清除缓冲液。添加 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液到磁珠沉淀物中，稍微涡旋以洗涤珠子。将试管放回磁分离架。一旦溶液变澄清，便清除缓冲液。再次进行洗涤步骤。

3. 添加 200 μl 细胞裂解物到 20 μl 预先洗涤的磁珠中。

   重要提示：最佳裂解物浓度将取决于目的蛋白的表达水平。建议起始浓度为 250 μg/ml-1.0 mg/ml。

4. 在室温下旋转孵育 20 分钟。
5. 使用一个磁分离架将珠子与裂解物分离，并将预澄清的裂解物转移到一根干净的试管中，随后去除磁珠沉淀物。
6. 继续进行免疫沉淀部分。

免疫沉淀法

重要提示：强烈建议使用相应的同型对照，以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗，把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗，把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗，把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗，把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗，Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配，并与一抗样品同时进行。

1. 将一抗（按产品数据表中建议的合适稀释比例）添加到 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜，从而形成免疫复合物。
2. 预先洗涤磁珠（参见细胞裂解物预澄清部分，步骤 1 和 2）。
3. 将裂解物和抗体（免疫复合物）溶液转移到一根含有已洗涤磁珠沉淀物的试管中。
4. 室温下振摇孵育 20 分钟。
5. 使用磁性分离架将磁珠沉淀小球。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
6. 继续使用免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

1. 在 20-40 µl 3X SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍微微量离心分离来让样品沉淀。
2. 将样品加热到 95–100°C，并持续 5 分钟。
3. 使用磁性分离架将磁珠沉淀小球。将上清液转移到新试管。上清液为样品。
4. 将样品上样 (15-30 µl) 至 SDS-PAGE上。
5. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注意：当使用兔源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）作为二抗，以尽量减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127），以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。

当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗，以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。

用激酶活性测定法进行分析

1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 1 分钟。
7. 将样品 (15-30 µl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。

免疫荧光法（免疫细胞化学法），CHAPS 实验步骤

重要信息：该实验步骤采用非典型的透化策略，仅某些目标与之兼容。TRITON^™ X-100 从所有缓冲液中取出，并用在 0.2％ CHAPS 去垢剂中的短暂孵育代替。在适当的情况下，该实验步骤将在特定于产品的网页上的“产品信息”横幅下链接至其经过验证的抗体。

A. 溶液与试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：要配制 1 L 1X PBS：添加 100 ml 10X 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水 (#12528) 到 900 ml dH₂O 中，混匀。调节 pH 至 8.0。
2. 4% 甲醛，无甲醇 (#47746)：使用新鲜。
3. CHAPS 通透缓冲液 （1X PBS / 0.2% CHAPS 去垢剂）：要制备 10 毫升，添加 0.02g CHAPS 去垢剂到 10 毫升 1X PBS，并混匀。
4. 无去垢剂的封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清）：要制备 10 ml，将 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（如 Normal Goat Serum (#5425) 添加至 9.5 ml 1X PBS） 并充分混匀。4°C 保存。
5. 无去垢剂的抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA)：要制备 10 ml，添加 0.1 g BSA (#9998) 至 10 ml 1X PBS 并混匀。4°C 保存。
6. 荧光素偶联的二抗：使用对您的一抗宿主物种（例如兔子）具有反应性的二抗。单击此处获得批准用于免疫荧光法的二抗列表。

B. 固定与透化

注意：所有后续孵育都应在室温（20-25°C）下进行， 除非另有说明。

1. 然后吸出培养基，用 4％ 的甲醛将细胞覆盖到 2 – 3 mm 的深度。
2. 可让细胞固定15分钟。
3. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 然后吸出 PBS，然后将固定的细胞在 CHAPS 通透缓冲液中孵育10分钟。
5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。

C. 免疫染色

1. 在无去垢剂的封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭时，在无去垢剂的抗体稀释缓冲液中制备一抗（建议的稀释范围请参见产品网站）。
3. 吸出封闭溶液，然后加入稀释后的一抗。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。

注意：如果使用荧光素偶联的一抗，则跳转到 Ｃ部分，第8步。

6. 用无去垢剂的抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后，避光孵育标本 1–2 小时。
7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。
8. 适当的复染。

注意：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括 DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。查看我们的经验证用于免疫荧光分析的细胞染料列表。

9. 安装样品进行成像。
10. 为了长期保存，请在 4°C 下避光保存样品。