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29002
B-Raf (V600E Mutant) (IHC600) Mouse mAb
一抗
单克隆抗体

B-Raf (V600E Mutant) (IHC600) Mouse mAb #29002

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筛选器:
  1. IHC
Immunohistochemistry Image 1: B-Raf (V600E Mutant) (IHC600) Mouse mAb
在 Leica® BOND Rx 上使用 B-Raf (V600E Mutant) (IHC600) Mouse mAb 对石蜡包埋的人甲状腺癌细胞进行免疫组织化学分析。通过基因组测序确认突变状态。
Immunohistochemistry Image 1: B-Raf (V600E Mutant) (IHC600) Mouse mAb
使用 B-Raf (V600E Mutant) (IHC600) Mouse mAb 对石蜡包埋的人结肠癌下表(左图,B-Raf V600E 阳性)和人结肠癌细胞(右图,B-Raf V600E 阴性)进行免疫组织化学分析。 通过基因组测序确认突变状态。
Immunohistochemistry Image 2: B-Raf (V600E Mutant) (IHC600) Mouse mAb
使用 B-Raf (V600E Mutant) (IHC600) Mouse mAb 对石蜡包埋的 A-375 异种移植物(左图,B-Raf V600E 阳性)和 MKN74 异种移植物(右图,野生型 B-Raf 阳性)进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 3: B-Raf (V600E Mutant) (IHC600) Mouse mAb
使用 B-Raf (V600E Mutant) (IHC600) Mouse mAb 对未转染(左图)、B-Raf 野生型转染(中图)和 B-Raf V600E 突变体转染(右图) 的石蜡包埋的 293T 细胞沉淀物进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 4: B-Raf (V600E Mutant) (IHC600) Mouse mAb
使用 B-Raf (V600E Mutant) (IHC600) Mouse mAb 对石蜡包埋的 SK-MEL-28 细胞沉淀物(左图,阳性)或 OVMANA 细胞沉淀物(右图,阴性)进行免疫组织化学分析。
To Purchase # 29002S
目录# 规格 价格 库存
29002S
100 µl

支持性数据

反应性 H
灵敏度 内源性
MW (kDa)
来源/同种型 小鼠 IgG2b、kappa

应用关键词:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
IHC-Leica® Bond™ 1:50 - 1:200
免疫组织化学(石蜡) 1:50 - 1:200

保存

保存在含 1%BSA和少于0.1%叠氮化钠的 Tris 缓冲液中。保存在 4°C 时,可保持稳定 24 个月。切勿分装抗体。‭

实验步骤

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免疫组织化学法 (Leica®BOND™)

:请参阅产品数据表或产品网页,了解合适的抗体稀释度^。

  步骤 试剂 时间/温度
1 脱蜡 BOND™ Dewax Solution、100% 乙醇、BOND™ Wash Solution 预编程的 Leica® BOND™ 
2 抗原修复  BOND™ Epitope Retrieval ER2 Solution 20 分钟,100˚C | 实验步骤:用 ER2 进行 HIER 20 分钟
3 过氧化物封闭液 Refine Detection Kit Peroxide Block* 5 分钟
  洗涤 BOND™ Wash Solution  3x 0:00 分钟
4 蛋白封闭液(可选) #5425 NGS 或 #15019 Animal-Free Blocking Solution   20 分钟 
5 一抗^ 用 #8112 SignalStain® Antibody Diluent 稀释 60 分钟 
  洗涤 BOND™ Wash Solution  3x 2:00 分钟
6 Post Primary Mouse Linker Refine Detection Kit Post Primary*  10 分钟 
  洗涤 BOND™ Wash Solution  3x 2:00 分钟
7 二次检测 Refine Detection Kit Polymer*  10 分钟 
  洗涤 BOND™ Wash Solution/Deionized Water 定制(参见下文)
8a 可视化 Refine Detection Kit Mixed DAB Refine*  0:00 分钟 
8b 可视化 Refine Detection Kit Mixed DAB Refine*  10 分钟 
  洗涤 去离子水 3x 0:00 分钟
9 复染 Refine Detection Kit Hematoxylin*  5 分钟 
  洗涤 去离子水 0:00 分钟 
  洗涤 BOND™ Wash Solution  0:00 分钟 
  洗涤 去离子水 0:00 分钟 
10 脱水(离线):    
  在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。  
  在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。  
  在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。  
11 用盖玻片和 #14177 SignalStain® Mounting Medium 封片。  
       
  可选订制洗涤: BOND™ Wash Solution 2:00
    BOND™ Wash Solution 分配器类型:打开 0:00
    BOND™ Wash Solution 2:00
    BOND™ Wash Solution 分配器类型:打开 0:00
    BOND™ Wash Solution 0:00
    去离子水 0:00

*BOND™ Polymer Refine Detection Kit(货号:DS9800)中所含的试剂

LEICA® 是 Leica Microsystems IR GmbH 的注册商标。

BOND™ 是 Leica Biosystems Melbourne Pty. Ltd 的商标。CST 和 Leica Microsystems IR GmbH 或 Leica Biosystems Melbourne Pty. Ltd 之间没有附属或赞助关系。

发布​时间 2018 年 8 月

修订时间 2018 年 9 月

实验步骤编号:1484

免疫组织化学(石蜡)

A. 溶液与试剂

注意:使用反渗透去离子 (RODI) 水或同等级别的水制备溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精(可选)。
  5. 洗涤缓冲液:
    1. 含 Tween®20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液 (TBST) :要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH2O 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112)。
  7. 1X EDTA 修复液:要制备250 mL 的 1X EDTA 修复液,使用 225 mL 的 dH2O 稀释25 ml 的 SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747)。
  8. 3% 过氧化氢:要制备 100 ml,添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备4 mL 的 dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Mouse #8125)。
  11. 底物:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  12. 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于 EDTA:将切片浸入 1X EDTA 修复液中,再放入微波炉中加热直到沸腾;继续保持 15分钟的亚沸腾温度 (95°-98°C)。无需冷却。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液,并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 让 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Mouse #8125) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 按需在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Mouse #8125)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中,使用前充分混合。
  12. 在每张切片上加 100–400 µl SignalStain® DAB,并密切观察,通常 5–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。
检测试剂/底物兼容性
推荐的
检测试剂
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Mouse) #31926
兼容的
色原
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632  

注意:使用非本实验步骤中指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗,以考虑检测试剂的不同灵敏度。

发布​时间 2015 年 2 月

修订时间 2020 年 4 月

实验步骤编号:1990

特异性/灵敏度

B-Raf (V600E Mutant) (IHC600) Mouse mAb 可识别 B-Raf 蛋白的 V600E 突变。

物种反应性:

来源/纯化

使用覆盖 V600E 突变的肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

A-Raf, B-Raf, c-Raf (Raf-1) 是通过 GTP 结合蛋白 Ras 所募集的主要效应因子,能激活 MEK-MAP 激酶通路 (1)。对 c-Raf 的活化了解最透彻,即涉及多个激活位点(包括 Ser338、Tyr341、Thr491、Ser494、Ser497 和 Ser499)的磷酸化 (2)。p21 激活的蛋白激酶 (PAK) 已证明可在 Ser338 位点磷酸化 c-Raf,并且 Src 家族可磷酸化 Tyr341 以诱导 c-Raf 活性 (3,4)。c-Raf 蛋白的 Ser338 位点与 A-Raf 的 Ser299 和 B-Raf 的 Ser445 相对应, 不过 B-Raf 的位点是持续性磷酸化的 (5)。c-Raf 上的抑制性 14-3-3 结合位点 Ser259 和 Ser621 可以分别由 Akt 和 AMPK 来磷酸化 (6,7)。虽然 A-Raf、B-Raf、c-Raf 的序列和功能相似,但是调节方式各不相同 (8)。值得注意的是,B-Raf 蛋白包含三个与 Akt 磷酸化共有位点(Ser364、 Ser428 和 Thr439 位点),但没有与 c-Raf Tyr341 相对应的位点 (8,9)。研究表明,B-Raf 蛋白的突变体 V600E,会导致激酶活性的升高,并且这种突变普遍存在于恶性黑色素瘤中 (10)。c-Raf 蛋白的六个位点(Ser29、Ser43、Ser289、Ser296、 Ser301 和 Ser642 位点)都过度磷酸化,这与 c-Raf 蛋白的失活相一致。这六个位点的过度磷酸化依赖于下游的 MEK 信号转导, 使得 c-Raf 对后续的激活事件无反应 (11)。
  1. Avruch, J. et al. (1994) Trends Biochem Sci 19, 279-83.
  2. Chong, H. et al. (2001) EMBO J 20, 3716-27.
  3. King, A.J. et al. (1998) Nature 396, 180-3.
  4. Fabian, J.R. et al. (1993) Mol Cell Biol 13, 7170-9.
  5. Mason, C.S. et al. (1999) EMBO J 18, 2137-48.
  6. Zimmermann, S. and Moelling, K. (1999) Science 286, 1741-4.
  7. Sprenkle, A.B. et al. (1997) FEBS Lett 403, 254-8.
  8. Marais, R. et al. (1997) J Biol Chem 272, 4378-83.
  9. Guan, K.L. et al. (2000) J Biol Chem 275, 27354-9.
  10. Davies, H. et al. (2002) Nature 417, 949-54.
  11. Dougherty, M.K. et al. (2005) Mol Cell 17, 215-24.

通路与蛋白质

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