蛋白质印迹法实验步骤
要进行蛋白质印迹法分析，在 4°C 下，将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育，轻晃孵育一整夜。
注意：请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。
A. 溶液和试剂
从样品制备至检测，蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit
注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
- 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
- 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
- 1X SDS 上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
- 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
- 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
- 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
- 脱脂奶粉：(#9999)。
- 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
- 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
- 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
- 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
- Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
- Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
- 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
- HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
- 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。
B. 蛋白质印迹
制备样品的常规流程。
- 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
- 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
- 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
- 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
- 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
- 微量离心机内离心 5 分钟。
上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。
- 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。
C. 膜封闭和抗体孵育
注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。
I. 膜封闭
- （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
- 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
- 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
II. 一抗孵育
- 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
- 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
- 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
- 继续进行检测（D 部分）。
D. 蛋白质检测
使用说明：
- 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
- 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
- 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。
* 避免反复接触皮肤。
发布于 2005 年 6 月
修订于 2020 年 6 月
实验步骤编号：10
免疫荧光法（免疫细胞化学）
A. 溶液和试剂
注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。
- 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
- 甲醇，100%
- 封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如 Normal Goat Serum (#5425)）和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
- 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (9998)，并混合。
建议使用偶联荧光素的抗兔二抗：
- Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。
B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)
注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。
- 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 冰冷的 100% 甲醇。
- 在 -20°C 温度下，可让细胞固定15分钟。
- 吸去固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
- 继续进行免疫染色操作（C 部分）。
C. 免疫染色
注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。
- 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
- 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
- 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
- 4°C 温度下孵育过夜。
- 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
- 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
- 按步骤 5 使用 1X PBS 漂洗。
- 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
- 为达到最佳效果，应立即采用适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。
实验步骤编号：3
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