查看特别推荐 >>
58169
β-Actin (E4D9Z) Mouse mAb
一抗
单克隆抗体

β-Actin (E4D9Z) Mouse mAb #58169

引用 (74)
筛选器:
  1. WB
  2. IF
  3. F
Western Blotting Image 1: β-Actin (E4D9Z) Mouse mAb
使用 β-Actin (E4D9Z) Mouse mAb 对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。
Immunofluorescence Image 1: β-Actin (E4D9Z) Mouse mAb
使用 β-Actin (E4D9X) Mouse mAb(绿色)和 PDI (C81H6) Rabbit mAb #3501(红色)对 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。
Flow Cytometry Image 1: β-Actin (E4D9Z) Mouse mAb
以浓度匹配的 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415(虚线)作为对照,使用 β-Actin (E4D9Z) Mouse mAb(实线)对 HeLa 细胞进行流式细胞分析。Anti-mouse IgG (H+L),F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4408 作为二抗。
To Purchase # 58169S
目录# 规格 价格 库存
58169S
100 µl

支持性数据

反应性 H M R
灵敏度 内源性
MW (kDa) 45
来源/同种型 小鼠 IgG2a

应用关键词:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:400
流式细胞术(固定/通透) 1:50

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。

实验步骤

打印

查看 > 收起 >

蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测,进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS:将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O,混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS):(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS:将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ,混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液,配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液: 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ,混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗:Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (#7076)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(#7076,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody(#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育并伴有轻轻摇晃,在室温下孵育 1 小时,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:19

免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液与试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 甲醇,100%
  4. 封闭缓冲液(1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 Normal Goat Serum (#5425))和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  5. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (9998),并混合。
  6. 建议使用荧光物质标记的 Anti-Mouse 二抗:

  7. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。注意:甲醛有毒性,仅可在通风橱中使用
  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸去固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 甲醇通透步骤:在细胞上覆盖冰冷的 100% 甲醇(使用足够的甲醇完全覆盖至 3–5 mm,不要让其干燥),并在 –20°C 下用甲醇孵育 10 分钟,同时用 1X PBS 漂洗 5 分钟。
  2. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  3. 封闭时,按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  4. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  5. 4°C 温度下孵育过夜
  6. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  7. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  8. 按步骤 6 使用 1X PBS 漂洗。
  9. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
  10. 为达到最佳效果,立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​时间 2006 年 11 月

修订时间 2010 年 12 月

实验步骤编号:146

针对兔抗体的甲醇通透实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):若要制备 1 L 1X PBS:将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水,混合。
  2. 4% 甲醛,无甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。
  5. 建议使用抗兔二抗:
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (PE Conjugate) #79408

:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活力指示染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品网页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com,了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定

:固定前,贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

:最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

:如果使用全血,则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白质的抗体。在固定和透化过程期间,这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 通过离心使细胞沉淀下来,移除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
  3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
  4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。以 0.5-1 ml 1 X PBS 重悬细胞。继续进行透化步骤。
    1. 或者,细胞可在 1X PBS 中 4°C 保存过夜。

C. 透化

  1. 通过温和涡旋混合的同时,向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度,使细胞透化。
  2. 在冰上透化最短 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞 在 90% 甲醇中 -20°C 保存。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。(通常,每次测定 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心以过量 1X PBS 洗涤分离,以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
  4. 室温孵育 1 小时。
  5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗(按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备)中重悬细胞。
  7. 室温孵育 30 分钟。避光。
  8. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  9. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上分析。

发布​时间 2009 年 7 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:404

特异性/灵敏度

β-Actin (E4D9Z) Mouse mAb 可检测总 β-肌动蛋白的内源水平。由于细胞质肌动蛋白同工型之间的高序列标识,β-肌动蛋白和细胞质 γ-肌动蛋白,该抗体可与细胞质 γ-肌动蛋白发生交叉反应。它不与 α-骨骼肌、α-心肌、α-血管平滑肌或 γ-肠道平滑肌同工型发生交叉反应。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠

来源/纯化

使用与人 β-肌动蛋白中 Ala7 周围的残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

作为一种普遍表达的真核蛋白,肌动蛋白是细胞骨架的一种主要组分。哺乳动物至少有 6 种已知的同工型。非肌肉 β 和 γ 肌动蛋白(也称细胞浆肌动蛋白)主要在非肌肉细胞中表达,可控制细胞结构和运动 (1)。所有肌动蛋白同工型都是高度同源的,细胞质 β- 和 γ 肌动蛋白序列仅因四种生化类似的氨基酸而异 (2)。因此,升高至 β 肌动蛋白的抗体可能与 γ 肌动蛋白发生交叉反应,反之亦然。α-心脏和 α 骨骼肌动蛋白在带状心脏和骨骼肌中表达,分别分别;两个平滑肌肉女演员,α- 和 γ-肌动蛋白,主要发现在血管平滑肌肉和肠道平滑肌肉中,。这些肌蛋白同工型可调节肌肉细胞收缩能力 (1)。肌动蛋白主要作为一种纤维聚合物纤丝状肌动蛋白而存在。在一些进程(如胞质分裂、内吞或应激)中,在细胞骨架重组信号的刺激下,丝切蛋白促进纤丝状肌动蛋白的片段化和解聚合导致单体球状形式球型肌动蛋白的增加 (3)。Arp2/3 复合体可稳定纤丝状肌动蛋白片段,并促进新肌动蛋白丝的形成 (3)。研究表明,肌动蛋白在原发性乳腺癌中被过度磷酸化 (4)。研究也表明,已经在体外、心肌和骨骼肌中观察到凋亡条件下的肌动蛋白的剪切 (5-7)。被 caspase-3 剪切的肌动蛋白,会加速泛素/蛋白酶体依赖的肌肉蛋白水解 (7)。
  1. Herman, I.M. (1993) Curr. Opin. Cell Biol. 5, 48-55.
  2. Perrin, B.J. and Ervasti, J.M. (2010) Cytoskeleton (Hoboken) 67, 630-4.
  3. Condeelis, J. (2001) Trends Cell Biol 11, 288-93.
  4. Lim, Y.P. et al. (2004) Clin Cancer Res 10, 3980-7.
  5. Kayalar, C. et al. (1996) Proc Natl Acad Sci U S A 93, 2234-8.
  6. Communal, C. et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99, 6252-6.
  7. Du, J. et al. (2004) J Clin Invest 113, 115-23.

通路

探索与本品相关的通路。

限制使用

除非 CST 的合法授书代表以书面形式书行明确同意,否书以下条款适用于 CST、其关书方或分书商提供的书品。 任何书充本条款或与本条款不同的客书条款和条件,除非书 CST 的合法授书代表以书面形式书独接受, 否书均被拒书,并且无效。

专品专有“专供研究使用”的专专或专似的专专声明, 且未专得美国食品和专品管理局或其他外国或国内专管机专专专任何用途的批准、准专或专可。客专不得将任何专品用于任何专断或治专目的, 或以任何不符合专专声明的方式使用专品。CST 专售或专可的专品提供专作专最专用专的客专,且专用于研专用途。将专品用于专断、专防或治专目的, 或专专售(专独或作专专成)或其他商专目的而专专专品,均需要 CST 的专独专可。客专:(a) 不得专独或与其他材料专合向任何第三方出售、专可、 出借、捐专或以其他方式专专或提供任何专品,或使用专品制造任何商专专品,(b) 不得复制、修改、逆向工程、反专专、 反专专专品或以其他方式专专专专专品的基专专专或技专,或使用专品开专任何与 CST 的专品或服专专争的专品或服专, (c) 不得更改或专除专品上的任何商专、商品名称、徽专、专利或版专声明或专专,(d) 只能根据 CST 的专品专售条款和任何适用文档使用专品, (e) 专遵守客专与专品一起使用的任何第三方专品或服专的任何专可、服专条款或专似专专

仅供研究使用。不得用于诊断流程。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
Alexa Fluor 是 Life Technologies 公司的注册商标。
所有其他商标均属各自所有者专有。访问我们的商标信息页面。
Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink