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39517
ATP6V1A (E5N9E) Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体

ATP6V1A (E5N9E) Rabbit mAb #39517

引用 (0)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1: ATP6V1A (E5N9E) Rabbit mAb
使用 ATP6V1A (E5N9E) Rabbit mAb 对来自各种人细胞系的提取物进行蛋白质印迹法分析。
Western Blotting Image 2: ATP6V1A (E5N9E) Rabbit mAb
使用 ATP6V1A (E5N9E) Rabbit mAb(上图)或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图)对经对照 siRNA (-) 或 ATP6V1A siRNA (+) 转染的 HeLa 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。
Western Blotting Image 3: ATP6V1A (E5N9E) Rabbit mAb
使用 ATP6V1A (E5N9E) Rabbit mAb(上图)、DYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAb #14793(中图)或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图),对空载转染 (-) 或表达 Myc/DDK 标记的全长人 ATP6V1A (hATP6V1A-Myc/DDK; +) 的构建体转染的 293T 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。
To Purchase # 39517S
目录# 规格 价格 库存
39517S
100 µl

支持性数据

反应性 H M R
灵敏度 内源性
MW (kDa) 75
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

在 10 mM HEPES 钠 (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中供应。-20℃ 保存。切勿分装抗体。‭

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹,在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜,同时柔和振摇。

注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测,进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS:将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O,混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS):(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS:将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ,混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液,配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液: 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ,混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

特异性/灵敏度

ATP6V1A (E5N9E) Rabbit mAb 可识别内源水平的 ATP6V1A 总蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠

来源/纯化

使用与人 ATP6V1A 蛋白的氨基末端周围残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

真核细胞含有称作液泡 H+-ATP 酶(V-ATP 酶)的 ATP 驱动型质子泵,这种质子泵使胞内区室酸化并且跨质膜转移质子 (1,2)。胞内 v-ATP 酶在内吞和胞内膜转运中发挥重要作用,而质膜 v-ATP 酶在尿酸化和骨吸收等多个过程发挥重要作用 (1,2)。液泡 ATP 酶是较大的异源多聚体蛋白复合体,在 V1 周围结构域或 V0 整合结构域存在组分蛋白 (2)。胞质 V1 结构域含有 A 和 B 催化性亚基的六聚物,以及 ATP 酶装配和 ATP 水解所需的多种其他蛋白质亚基。V0 v-ATP 酶整合结构域显示蛋白质转移酶活性,并且负责跨膜转运质子 (2)。研究证明,v-ATP 酶亚基 ATP6V0c、ATP6V0d1、ATP6V1A、ATP6V1B2 和 ATP6V1D 与调节蛋白复合体相互作用,并且为溶酶体表面上氨基酸诱导的 mTORC1 激活所必需 (3)。此外,已证明 ATP6V1A 与 SARS-CoV-2 M 蛋白相互作用并促进病毒感染 (4,5)。
  1. Marshansky, V. and Futai, M. (2008) Curr Opin Cell Biol 20, 415-26.
  2. Jefferies, K.C. et al. (2008) Arch Biochem Biophys 476, 33-42.
  3. Zoncu, R. et al. (2011) Science 334, 678-83.
  4. Gordon, D.E. et al. (2020) Nature 583, 459-468.
  5. Daniloski, Z. et al. (2021) Cell 184, 92-105.e16.

通路与蛋白质

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