反应性 | H M R |
灵敏度 | 内源性 |
MW (kDa) | 72 |
来源/同种型 | 兔 IgG |
产品信息
应用 | 稀释度 |
---|---|
蛋白质印迹法 | 1:1000 |
免疫沉淀法 | 1:50 |
蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。
注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。
注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。
* 避免反复接触皮肤。
发布时间 2005 年 6 月
修订时间 2020 年 6 月
实验步骤编号:263
本实验步骤适用于使用 Protein A agarose beads 对天然蛋白进行免疫沉淀,以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。
注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。
重要提示:强烈建议使用相应的同型对照,以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗,把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗,把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗,把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗,把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗,Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。
继续下述其中一项的具体步骤。
注意:当使用兔源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)作为二抗,以尽量减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白,建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127),以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。
当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗,以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。
发布时间 2008 年 12 月
修订时间 2021 年 10 月
实验步骤编号:409
人, 小鼠, 大鼠
使用与人 Atg13 蛋白 Asp462 周围的残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。
自噬是自噬溶酶体降解大部分细胞浆内容物的一种分解代谢过程 (1,2)。通常在营养剥夺条件下激活自噬,但自噬也与一些生理过程有关,如发育、分化、神经变性、感染和癌症 (3)。已在酵母中大量发现自噬的分子机制,被称为自噬基因 (Atg)。
Atg13/Apg13 最初作为一种结构性表达蛋白发现于酵母中,这种蛋白在基因层面与 Atg1/Apg1 相连,后者是自噬所需的一种蛋白激酶 (4)。Atg1 过表达会抑制在 Atg13 突变体中观察到的自噬缺陷 (4)。自噬过程需要 Atg1 与 Atg13 之间的直接结合,并且在高营养条件下受 Atg13 的 TOR 依赖性磷酸化的抑制 (5)。同样,哺乳动物的 Atg13 与 Atg1 同源蛋白 ULK1/2 和 FIP200 形成一个复合体,该复合体定位至自噬隔离膜并调节自噬体的生物合成 (6-8)。mTOR 磷酸化 Atg13 和 ULK1,进而抑制 ULK1 激酶活性和自噬 (7-9)。ULK1 可在一个尚未鉴定的位点直接磷酸化 Atg13,推测其可促进自噬 (7,8)。其他研究表明,Atg13 和 FIP200 的作用不受 ULK1 和 ULK2 的影响,并通过一种未知机制诱导自噬 (10)。
探索与本品相关的通路。
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