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32205
ARH3 (E8A6G) Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体
R
重组

ARH3 (E8A6G) Rabbit mAb #32205

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筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1: ARH3 (E8A6G) Rabbit mAb
使用 ARH3 (E8A6G) Rabbit mAb(上图)或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图)对来自 SK-MEL-5 细胞和 U-87 MG 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。
Western Blotting Image 2: ARH3 (E8A6G) Rabbit mAb
使用 ARH3 (E8A6G) Rabbit mAb(上图)或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图)对来自各种细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。
To Purchase # 32205S
目录# 规格 价格 库存
32205S
100 µl

支持性数据

反应性 H M R
灵敏度 内源性
MW (kDa) 39
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

在 10 mM HEPES 钠 (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中供应。-20℃ 保存。切勿分装抗体。‭

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹,在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜,同时柔和振摇。

注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测,进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS:将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O,混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS):(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS:将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ,混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液,配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液: 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ,混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

特异性/灵敏度

ARH3 (E8A6G) Rabbit mAb 识别内源水平的 ARH3 总蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠

来源/纯化

使用与人 ARH3 蛋白的 Pro241 周围残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

ADP-核糖基化是一种可逆翻译后修饰 (PTM),其中来自 β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 的 ADP-核糖 (ADPr) 基团的单个单元或聚合物转移到靶标蛋白的特定残基上 (1)。除蛋白质外,也确定 DNA 分子和 RNA 分子为 ADP-核糖基化的靶标 (2,3)。这种修饰受一组不同的 ADP-核糖基转移酶 (ART) 催化,这些酶大多数作用在于添加单个 ADPr 单元 (MAR 化) ,而聚(ADP-核糖)聚合酶 (PARP) 完成多重 ADPr 的沉积。ADP-核糖基化的逆转由进化上不同的宏结构域和 ADP-核糖基水解酶 (ARH) 蛋白家族实现 (4)。具体而言,聚(ADP-核糖)糖水解酶 (PARG) 或 ADP-核糖基水解酶 3 (ARH3) 将 PAR 化物降解至单个 ADPr 单元,而 MacroD1、MacroD2、TARG1 或 ARH1 将它们从靶标残余物完全移除 (5)。ADP-核糖基化及其调节酶参与广泛的细胞过程,例如 DNA 修复、染色质调节、转录和细胞应激反应 (1,4)。此外,已证明 ADP-核糖基化在各种癌症、神经退行性疾病和炎症中是治疗关键性 PTM (6)。

ADP-核糖水解酶的 ARH 家族包含氨基酸序列相似但酶活性不同的三种蛋白质。ARH3,亦称 ADPRHL2,是一种以细胞类型特异性方式定位于胞核、胞质和线粒体的遍在性蛋白质 (7-9)。ARH3 在其偏好水解 DNA 损伤所诱导丝氨酸 ADP-核糖基化方面表现出与 PARG 存在部分冗余,这奠定这些酶在维持基因组稳定性中的关键作用。已证明 Arh3-KO 小鼠响应于缺血再灌注损伤出现脑梗死增加 (10),而人类 ARH3 缺陷是一种征在于神经退行性病变和早期死亡的隐性常染色体罕见疾病 (11,12)。
  1. Gibson, B.A. and Kraus, W.L. (2012) Nat Rev Mol Cell Biol 13, 411-24.
  2. Jankevicius, G. et al. (2016) Mol Cell 64, 1109-1116.
  3. Munnur, D. et al. (2019) Nucleic Acids Res 47, 5658-5669.
  4. Rack, J.G.M. et al. (2020) Genes Dev 34, 263-284.
  5. Vivelo, C.A. and Leung, A.K. (2015) Proteomics 15, 203-17.
  6. Curtin, N.J. and Szabo, C. (2013) Mol Aspects Med 34, 1217-56.
  7. Oka, S. et al. (2006) J Biol Chem 281, 705-13.
  8. Niere, M. et al. (2012) J Biol Chem 287, 16088-102.
  9. Mashimo, M. et al. (2013) Proc Natl Acad Sci USA 110, 18964-9.
  10. Mashimo, M. et al. (2019) JCI Insight 4, e124519. doi: 10.1172/jci.insight.124519.
  11. Danhauser, K. et al. (2018) Am J Hum Genet 103, 817-825.
  12. Ghosh, S.G. et al. (2018) Am J Hum Genet 103, 431-439.

通路与蛋白质

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