反应性 | H M R Mk |
敏感性 | 内源性 |
MW (kDa) | 28 |
来源/亚型 | 兔 IgG |
产品信息
应用 | 稀释度 |
---|---|
蛋白质印迹法 | 1:1000 |
免疫沉淀 | 1:50 |
保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。
要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。
注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。
从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit
注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。
注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。
* 避免反复接触皮肤。
发布于 2005 年 6 月
修订于 2020 年 6 月
实验步骤编号:10
本实验步骤适用于使用蛋白 A 磁珠分离法对天然蛋白进行免疫沉淀,以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。
注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。
注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。
强烈建议进行细胞裂解物预清除步骤,以减少结合 Protein A Magnetic beads 的非特异性蛋白。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。
重要提示:使用前,预先洗涤 #73778 磁珠:
一旦溶液变澄清,便小心清除缓冲液。添加 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液到磁珠沉淀物中,稍微涡旋以洗涤珠子。将试管放回磁分离架。一旦溶液变澄清,便清除缓冲液。再次进行洗涤步骤。
重要提示:最佳裂解物浓度将取决于目的蛋白的表达水平。建议起始浓度为 250 μg/ml-1.0 mg/ml。
重要提示:强烈建议使用相应的同型对照,以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。使用 Normal Rabbit IgG #2729、Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 和 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 分别进行兔多克隆一抗、兔单克隆一抗和小鼠单克隆一抗的对照检测。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。
继续下述其中一项的具体步骤。
注意:为了最大限度减少变性 IgG 重链 (~50 kDa) 产生的遮盖作用,我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP 缀合物 #5127)。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)
发布于 2008 年 12 月
修订于 2018 年 4 月
实验步骤编号:410
ARD1A (E1J2B) Rabbit mAb 可识别 ARD1A 总蛋白的内源水平。
人, 小鼠, 大鼠, 猴
仓鼠 , 马
使用与人 ARD1A 蛋白 Asp204 周围的残基对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。
蛋白质乙酰化是在蛋白质内部赖氨酸残基(ε-氨基乙酰化)处和在蛋白质氨基末端的多个氨基酸残基处(α-氨基乙酰化)发生的常见修饰。N-α-乙酰转移酶 ARD1 同源物 A 蛋白(ARD1A,也称作 NAA10)和高度同源的 N-α-乙酰转移酶 ARD1 同源物 B 蛋白(ARD1B,也称作 ARD2 或 NAA11)是氨基末端乙酰转移酶复合体 (NatA) 的互斥催化性亚基 (1-3)。该复合体由 ARD1A 或 ARD1B 和 N-α-乙酰转移酶15 (NAA15) 辅助蛋白组成,定位至核糖体,并在蛋白质翻译期间,在起始子甲硫氨酸剪切后,乙酰化 Ser、Ala-、Gly-、Thr-、Cys-、Pro- 和 Val-氨基末端 (1-5)。与 ε-氨基乙酰化类似,氨基末端 α-氨基乙酰化起到以下作用:调节蛋白质稳定性、活性、细胞定位和蛋白质间相互作用 (4,5)。研究表明,ARD1A 中的缺陷造成氨基末端乙酰转移酶缺乏症 (NATD),其导致出生后生长重度延迟和缺陷 (6)。
除作为 NatA 复合体中的氨基末端乙酰转移酶发挥作用之外,游离的 ARD1A 蛋白和 ARD1B 蛋白通过 ε-氨基乙酰化多种靶标蛋白(包括 HIF-1α、β-联蛋白和 AP-1 转录因子)中的赖氨酸残基的,调节细胞生长和分化 (7-9)。在常氧条件下, ARD1A 介导 HIF-1α 在 Lys532 处的乙酰化,可增强 VHL 的结合作用,导致 HIF-1α 的泛素化及降解增加,并造成涉及血管生成、凋亡、细胞增殖和葡萄糖代谢的 HIF-1α 靶标基因下调 (7)。低氧条件下, ARD1A 的表达减少有助于稳定 HIF-1α 和上调靶标基因 (7)。ARD1A 还通过乙酰化和激活 β-联蛋白和 AP-1 转录因子,刺激细胞周期蛋白 D1 表达,进而促进细胞增殖和肿瘤形成 (8,9)。有趣的是,ARD1A 的乙酰转移酶活性受 Lys136 处的自体乙酰化调节,ARD1A 促进增殖和肿瘤形成的能力需要这种自体乙酰化 (9)。研究表明, ARD1 蛋白在多种癌症(包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结直肠癌)中过量表达 (10-13)。
探索与本品相关的通路 + 蛋白。
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