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13357
ARD1A (E1J2B) Rabbit mAb
一抗
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ARD1A (E1J2B) Rabbit mAb #13357

引用 (2)
筛选器：
  1. WB
  2. IP
Western Blotting Image 1: ARD1A (E1J2B) Rabbit mAb
使用 ARD1A (E1J2B) 兔单抗对来自不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。
Immunoprecipitation Image 1: ARD1A (E1J2B) Rabbit mAb
使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® 同型对照 #3900（泳道 2）或 ARD1A (E1J2B) 兔单抗（泳道 3），对来自 293 细胞提取物的 ARD1A 进行免疫沉淀。泳道 1 是 10% 输入对照。使用 ARD1A (E1J2B) 兔单抗进行蛋白质印迹分析。
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13357S		 100 µl

定制制剂

支持数据

反应性 H M R Mk
敏感性 内源性
MW (kDa) 28
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫沉淀 1:50

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析，在 4°C 下，将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育，轻晃孵育一整夜。

注意：请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测，蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
  14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#59329，10 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号：10

天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于使用蛋白 A 磁珠分离法对天然蛋白进行免疫沉淀，以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS，将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O 中并混合。

  2. 10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O，并混合。

    注意：使用前，请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

  3. 3X SDS上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。
  4. Protein A Magnetic Beads：(#73778)。
  5. 磁分离架：(#7017) 或 (#14654)。
  6. 10X 激酶缓冲液（用于激酶试验）：(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  7. ATP (10 mM)（用于激酶试验）：(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM)，将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。
  6. 在 4°C，在 14,000 x g 条件下，微量离心 10 分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清（可选）

强烈建议进行细胞裂解物预清除步骤，以减少结合 Protein A Magnetic beads 的非特异性蛋白。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。

  1. 稍微涡旋母液试管，以重悬磁珠。

    重要提示：使用前，预先洗涤 #73778 磁珠：

  2. 转移 20 μl 珠浆到一根干净的试管中。将试管放在磁分离架上 10-15 秒钟。

    一旦溶液变澄清，便小心清除缓冲液。添加 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液到磁珠沉淀物中，稍微涡旋以洗涤珠子。将试管放回磁分离架。一旦溶液变澄清，便清除缓冲液。再次进行洗涤步骤。

  3. 添加 200 μl 细胞裂解物到 20 μl 预先洗涤的磁珠中。

    重要提示：最佳裂解物浓度将取决于目的蛋白的表达水平。建议起始浓度为 250 μg/ml-1.0 mg/ml。

  4. 在室温下旋转孵育 20 分钟。
  5. 使用一个磁分离架将珠子与裂解物分离，并将预澄清的裂解物转移到一根干净的试管中，随后去除磁珠沉淀物。
  6. 继续进行免疫沉淀部分。

免疫沉淀

重要提示：强烈建议使用相应的同型对照，以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗，把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗，把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗，把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗，把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗，Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配，并与一抗样品同时进行。

  1. 将一抗（按产品数据表中建议的合适稀释比例）添加到 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜，从而形成免疫复合物。
  2. 预先洗涤磁珠（参见细胞裂解物预澄清部分，步骤 1 和 2）。
  3. 将裂解物和抗体（免疫复合物）溶液转移到一根含有已洗涤磁珠沉淀物的试管中。
  4. 室温下振摇孵育 20 分钟。
  5. 使用磁性分离架将磁珠沉淀小球。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
  6. 继续使用免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 在 20-40 µl 3X SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍微微量离心分离来让样品沉淀。
  2. 将样品加热到 95–100°C，并持续 5 分钟。
  3. 使用磁性分离架将磁珠沉淀小球。将上清液转移到新试管。上清液为样品。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注意：为了最大限度减少变性 IgG 重链 (~50 kDa) 产生的遮盖作用，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP 缀合物 #5127）。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa)，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）

用激酶活性测定法进行分析

  1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 1 分钟。
  7. 将样品 (15-30 µl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。

发布​于 2008 年 12 月 

修订于 2021 年 4 月

实验步骤编号：410

特异性/敏感性

ARD1A (E1J2B) Rabbit mAb 可识别 ARD1A 总蛋白的内源水平。

物种反应性：

人, 小鼠, 大鼠, 猴

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种：

仓鼠 , 马

来源/纯化

使用与人 ARD1A 蛋白 Asp204 周围的残基对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

蛋白质乙酰化是在蛋白质内部赖氨酸残基（ε-氨基乙酰化）处和在蛋白质氨基末端的多个氨基酸残基处（α-氨基乙酰化）发生的常见修饰。N-α-乙酰转移酶 ARD1 同源物 A 蛋白（ARD1A，也称作 NAA10）和高度同源的 N-α-乙酰转移酶 ARD1 同源物 B 蛋白（ARD1B，也称作 ARD2 或 NAA11）是氨基末端乙酰转移酶复合体 (NatA) 的互斥催化性亚基 (1-3)。该复合体由 ARD1A 或 ARD1B 和 N-α-乙酰转移酶15 (NAA15) 辅助蛋白组成，定位至核糖体，并在蛋白质翻译期间，在起始子甲硫氨酸剪切后，乙酰化 Ser、Ala-、Gly-、Thr-、Cys-、Pro- 和 Val-氨基末端 (1-5)。与 ε-氨基乙酰化类似，氨基末端 α-氨基乙酰化起到以下作用：调节蛋白质稳定性、活性、细胞定位和蛋白质间相互作用 (4,5)。研究表明，ARD1A 中的缺陷造成氨基末端乙酰转移酶缺乏症 (NATD)，其导致出生后生长重度延迟和缺陷 (6)。

除作为 NatA 复合体中的氨基末端乙酰转移酶发挥作用之外，游离的 ARD1A 蛋白和 ARD1B 蛋白通过 ε-氨基乙酰化多种靶标蛋白（包括 HIF-1α、β-联蛋白和 AP-1 转录因子）中的赖氨酸残基的，调节细胞生长和分化 (7-9)。在常氧条件下， ARD1A 介导 HIF-1α 在 Lys532 处的乙酰化，可增强 VHL 的结合作用，导致 HIF-1α 的泛素化及降解增加，并造成涉及血管生成、凋亡、细胞增殖和葡萄糖代谢的 HIF-1α 靶标基因下调 (7)。低氧条件下， ARD1A 的表达减少有助于稳定 HIF-1α 和上调靶标基因 (7)。ARD1A 还通过乙酰化和激活 β-联蛋白和 AP-1 转录因子，刺激细胞周期蛋白 D1 表达，进而促进细胞增殖和肿瘤形成 (8,9)。有趣的是，ARD1A 的乙酰转移酶活性受 Lys136 处的自体乙酰化调节，ARD1A 促进增殖和肿瘤形成的能力需要这种自体乙酰化 (9)。研究表明， ARD1 蛋白在多种癌症（包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结直肠癌）中过量表达 (10-13)。
  1. Arnesen, T. et al. (2005) Biochem J 386, 433-43.
  2. Arnesen, T. et al. (2006) BMC Biochem 7, 13.
  3. Pang, A.L. et al. (2009) Biol Reprod 81, 302-9.
  4. Van Damme, P. et al. (2011) FEBS J 278, 3822-34.
  5. Polevoda, B. and Sherman, F. (2000) J Biol Chem 275, 36479-82.
  6. Rope, A.F. et al. (2011) Am J Hum Genet 89, 28-43.
  7. Jeong, J.W. et al. (2002) Cell 111, 709-20.
  8. Lim, J.H. et al. (2006) Cancer Res 66, 10677-82.
  9. Seo, J.H. et al. (2010) Cancer Res 70, 4422-32.
  10. Arnesen, T. et al. (2005) Thyroid 15, 1131-6.
  11. Ren, T. et al. (2008) Cancer Lett 264, 83-92.
  12. Yu, M. et al. (2009) Oncol Rep 21, 909-15.
  13. Yu, M. et al. (2009) Cancer Invest 27, 978-83.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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