反应性 | H M R Mk |
灵敏度 | 内源性 |
MW (kDa) | 10 |
来源/同种型 | 兔 IgG |
产品信息
应用 | 稀释度 |
---|---|
蛋白质印迹法 | 1:1000 |
免疫沉淀法 | 1:100 |
为了进行蛋白质印迹,在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜,同时柔和振摇。
注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。
从样品制备至检测,进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。
注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。
* 避免反复接触皮肤。
发布时间 2005 年 6 月
修订时间 2020 年 6 月
实验步骤编号:10
本实验步骤适用于使用 Protein A agarose beads 对天然蛋白进行免疫沉淀,以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。
注:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。
注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。
重要提示:强烈建议使用相应的同型对照,以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗,把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗,把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗,把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗,把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗,Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。
继续下述其中一项的具体步骤。
注意:当使用兔源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)作为二抗,以尽量减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白,建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127),以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。
当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗,以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。
发布时间 2008 年 12 月
修订时间 2021 年 10 月
实验步骤编号:409
人, 小鼠, 大鼠, 猴
使用全长人重组 APC11 蛋白对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。
真核细胞增殖完全依赖于后期促进复合体/周期体 (APC/C) 的 E3 泛素连接酶活性,而复合体/周期体的主要功能是触发细胞周期从中期到后期的转变。APC/C 复合体可促进多泛素链在底物蛋白上的组装,以靶向这些蛋白质进而被 26S 蛋白酶体降解 (1,2)。脊椎动物 APC/C 复合体由多达 15 种亚基组成,这些亚基包括多种支架蛋白、两种催化性亚基(APC2、APC11)和多种负责底物识别的蛋白质 (3)。包括 APC/C 在内的所有 E3 酶均利用由 E1 酶激活并转移至 E2 酶的泛素残基。研究显示 APC/C 通过含有 RING-指结构域的亚基 APC11,与 E2 酶 UBE2S 和 UBE2C 相互作用 (4-6)。APC/C 功能依赖于多种辅因子,包括由细胞分裂控制蛋白 20 同源物 (CDC20) 和 Cdh1/FZR1 形成的 APC/C 共激活因子。CDC20/Cdh1 共激活因子负责:通过与底物内部的特定 D 框识别元件和 KEN 框识别元件相互作用来识别 APC/C 底物 (7-9)。
后期促进复合体亚基 11 (APC11) 携带一个 RING-H2 基序,该基序特征为拥有一系列负责锌阳离子配位的非串联 His 和 Cys 残基。RING 盒蛋白 RBX1 和 RBX2 是 SCF 泛素连接酶复合体中含有 RING-H2 基序的亚基,在一级氨基酸层面,APC11 显示出与两者的序列相似性 (10)。含有 APC11 和 cullin 样亚基的异二聚体复合体 APC2 形成 APC/C 的催化性核心并且对 APC/C 催化泛素链延伸至关重要 (4,11)。
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