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35277
AMPK Substrate Antibody Sampler Kit
一抗
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AMPK Substrate Antibody Sampler Kit #35277

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AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 1

使用 Phospho-AMPKα (Thr172) (D4D6D) Rabbit mAb 对未经（左图）或已经苯乙双胍（右图）处理的石蜡包埋的 NCI-H2228 细胞沉淀物进行免疫组织化学分析。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 2

使用 AMPKα (D5A2) Rabbit mAb 对 HeLa、K-562、C6 和 Neuro-2a 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 3

使用 Phospho-ULK1 (Ser555) (D1H4) Rabbit mAb 对未处理的或经 oligomycin #9996（0.5 μM，持续30 分钟）处理的 MCF7 细胞提取物，以及未处理的或经过氧化氢（10 mM，持续5分钟）处理的 C2C12 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

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使用 ULK1 (D8H5) Rabbit mAb 对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 5

使用 Phospho-Raptor (Ser792) Antibody（左上和下）或 Raptor Antibody #2280（右上和下）对未经处理或经 AICAR（0.5 mM，30 分钟）或 oligomycin（0.5 μM，30 分钟）处理的 C2C12 或 293 细胞进行蛋白质印迹分析。

200 kDa 的交叉反应条带*。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 6

使用 Raptor (24C12) Rabbit mAb 对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 7

使用 Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb 对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 8

使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP®Isotype Control #3900(泳道2) 或 Phospho-Beclin-1 (Ser93) (D9A5G) Rabbit mAb (泳道3)，对经羰基氰化物 3- 氯苯基二腙 (CCCP) 处理的 KARPAS-299 细胞 (100μM，2小时) 中的 phospho-Beclin-1 (Ser93) 进行免疫沉淀。泳道 1 是 10% 输入对照。使用 Phospho-Beclin-1 (Ser93) (D9A5G) Rabbit mAb 进行蛋白质印迹分析。使用 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb#3678作为二抗，避免与 IgG 重链交叉反应。细胞系来源：University of Cambridge 的 Abraham Karpas 博士。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 9

一抗与靶标蛋白结合之后，与偶联 HRP 的二抗形成复合体。添加 LumiGLO®，在酶催化分解期间发光。

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使用 Phospho-AMPKα (Thr172) (D4D6D) Rabbit mAb 对对照品（左图）或经 λ 磷酸酶处理（右图）的石蜡包埋的人结肠癌细胞进行免疫组织化学分析。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 11

使用 Phospho-ULK1 (Ser555) (D1H4) Rabbit mAb（左图）对未处理的或经 oligomycin #9996（0.5 µM，持续30 分钟）处理的 MCF7 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。使用磷酸化（中间图）或在 ULK1 的 Ser555 周围区域的非磷酸化肽（右图）来预孵育抗体，从而证实磷酸化的特异性。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 12

使用 ULK1 (D8H5) Rabbit mAb（上图）和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）对野生型 MEF 和 ULK1 (-/-) MEF 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。MEF 细胞由 Reuben Shaw 博士 (Salk Institute, La Jolla, CA) 惠赠。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 13

使用 Phospho-Raptor (Ser792) Antibody（上）或 Raptor Antibody #4978（下）对未经处理或经 AICAR（2 mM，1 小时）处理的野生型 (WT) 以及 AMPKα1 和 α2 敲除 (KO) 小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 进行蛋白质印迹分析。（图像由 Salk 生物研究所的 Reuben Shaw 博士提供）。

60、70 和 240 kDa 的交叉反应条带*。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 14

使用 Beclin-1 (D40C5) XP® Rabbit mAb #3495（上）或 α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb #2125（下）对经 100 nM SignalSilence® Control siRNA (Unconjugated) #6568 (-)、SignalSilence® Beclin-1 siRNA I #6222 (+) 或 SignalSilence® Beclin-1 siRNA II (+) 转染的 Hela 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。Beclin-1 (D40C5) XP® Rabbit mAb 可确认 Beclin-1 的表达沉默，而 α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb 则用作观察上样量和 Beclin-1 siRNA 的特异性。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 15

使用 Phospho-Beclin-1 (Ser93) (D9A5G) Rabbit mAb (上图) 和 Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb #3495(下图)，对未经处理 (-) 或已经羰基氰化物 -3- 氯苯腙 (CCCP，100μM，2小时; +) 处理的 MCF7 和 KARPAS-299 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。细胞系来源：University of Cambridge 的 Abraham Karpas 博士。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 16

使用 Phospho-AMPKα (Thr172) (D4D6D) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人卵巢癌细胞进行免疫组织化学分析。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 17

使用 Phospho-ULK1 (Ser555) (D1H4) Rabbit mAb（上图）或 ULK1 (D8H5) Rabbit mAb #8054（下图）对未处理的 (-) 或经羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)（100 μM，持续2 小时； +）处理的 MCF7 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 18

使用 Phospho-Beclin-1 (Ser93) (D9A5G) Rabbit mAb (上图) 和 Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb #3495(下图)，对未经处理 (-) 或经羰基氰化物-3-氯苯腙 (CCCP，100 μM，2小时; +) 处理及转染空载 (-) 或转染表达全长人 Beclin-1 (hBeclin-1; +) 的表达载体的 293T 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 19

在有对照肽（左图）或抗原特异性肽（右图）的情况下，使用 Phospho-AMPKα (Thr172) (D4D6D) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人肺癌细胞进行免疫组织化学分析。

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit: Image 20

使用 Phospho-AMPKα (Thr172) (D4D6D) Rabbit mAb（上图）或 AMPKα (D63G4) Rabbit mAb #5832（下图），对未经 (-) 或已经苯乙双胍（5 mM，1 小时；+）处理的血清饥饿 NCI-H2228 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

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35277T		 1 个试剂盒(8 x 20 µl)

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产品说明

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit 提供一种性价比高的方法来检测 AMPK 的总磷酸化底物。该试剂盒包含足够抗体，每种一抗可用于两次蛋白质印迹实验。

特异性/敏感性

AMPK Substrate Antibody Sampler Kit 中的每种抗体可检测其靶蛋白的内源水平。Phospho-AMPKα (Thr172) (D4D6D) Rabbit mAb 和

AMPKα (D5A2) Rabbit mAb 可检测催化亚基的 α1 和 α2 同工型。仅当小鼠 ULK1 的 Ser555（相当于人 ULK1 的 Ser556 ）发生磷酸化时，Phospho-ULK1 (Ser555) (D1H4) Rabbit mAb 才能检测 ULK1 的内源水平。在 90 和 100 kDa 之间检测到未知来源的条带。Phospho-Raptor (Ser792) Antibody 可检测各种分子量的非特异性信号。Phospho-Beclin-1 (Ser93) (D9A5G) Rabbit mAb 可检测 Ser93 和 Ser96 双重磷酸化，但在较大程度上能检测 Ser93 单磷酸化。该抗体也可微弱检测分子量大小约为 70 kDa 的未知条带。

来源/纯化

使用合成肽以及与人 AMPKα 蛋白的 Ser172、人 AMPKα 蛋白的 Arg21、小鼠 ULK1 蛋白的 Ser555（相当于人 ULK1 的 Ser556）、人 ULK1 的 Arg600、人 Raptor 的 Glu11、人 Beclin-1 的 Ser93（小鼠中的 Ser91）和人 Beclin-1 的 Thr72 周围的残基相对应的磷酸肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。使用与人 raptor 中 Ser792 周围序列相对应的合成磷酸肽，对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。抗体经肽亲和层析进行纯化。

背景

AMP 激活的蛋白激酶 (AMPK) 从酵母到植物和动物中都高度保守，且在调节能量平衡方面发挥关键作用 (1)。AMPK 蛋白以一种异三聚体复合体的形式存在，由一个 α-催化亚基、一个 β-调节亚基和一个 γ-调节亚基组成，每个亚基被两到三个不同基因编码 (α1、2；β1、2；γ1、2、3) (2)。该激酶会被因细胞和环境压力引起AMP/ ATP 比值升高而激活，如热休克，缺氧和缺血 (1)。抑癌基因 LKB1 与辅助蛋白 STRAD 和 MO25 一同将位于活化环里 Thr172 位点的 AMPKα 磷酸化，该位点的磷酸化是 AMPK 激酶活性所必需的 (3-5)。

AMPK 会磷酸化许多调控细胞进程（如代谢、细胞生长和自噬）的靶标 (6)。它会抑制哺乳动物 rapamycin 靶标 (mTOR) 的活性，mTOR 在促进细胞生长方面发挥关键作用。mTOR (Raptor) 的调节相关蛋白被确认为可介导 mTOR 信号转导至下游靶标的 mTOR 结合配偶体 (7,8)。Raptor 通过其 TOR 信号转导 (TOS) 基序与 mTOR 底物（包括 4E-BP1 和 p70 S6 激酶）结合，并且是 mTOR 介导这些底物磷酸化所需的 (9,10)。AMPK 直接磷酸化 Raptor Ser722/Ser792，这种磷酸化是抑制含 raptor 的 mTOR 复合体 1 (mTORC1) 所必需的，并在细胞经受能量应激时诱导细胞周期停滞 (11)。AMPK 还通过直接磷酸化 ULK1 来促进自噬 (11,12)。ULK1 是自噬体起始和形成所必需的一种丝氨酸/苏氨酸激酶。在营养不足情况下被激活的 AMPK 可直接磷酸化多个位点的 ULK1，包括 Ser317、Ser555 和 Ser777 (11,12)。相反，作为细胞生长的调节分子和自噬的抑制蛋白， mTOR 可磷酸化 ULK1 Ser757，并破坏 ULK1 和 AMPK 之间的相互作用 (11)。AMPK 还直接磷酸化 Beclin-1，Beclin-1 是自噬体形成期间 ULK1 下游复合体的组分，能够激活 III 类磷脂酰肌醇-3 激酶 VPS34。AMPK 会磷酸化人 Beclin-1 Ser93 和 Ser96 残基，这些残基对应于小鼠 Ser91 和 Ser94 (14)。

  1. Hardie, D.G. (2004) J Cell Sci 117, 5479-87.
  2. Carling, D. (2004) Trends Biochem Sci 29, 18-24.
  3. Hawley, S.A. et al. (1996) J Biol Chem 271, 27879-87.
  4. Lizcano, J.M. et al. (2004) EMBO J 23, 833-43.
  5. Shaw, R.J. et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101, 3329-35.
  6. Mihaylova, M.M. and Shaw, R.J. (2011) Nat Cell Biol 13, 1016-23.
  7. Hara, K. et al. (2002) Cell 110, 177-89.
  8. Kim, D.H. et al. (2002) Cell 110, 163-75.
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  10. Nojima, H. et al. (2003) J Biol Chem 278, 15461-4.
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  12. Kim, J. et al. (2011) Nat Cell Biol 13, 132-41.
  13. Egan, D.F. et al. (2011) Science 331, 456-61.
  14. Kim, J. et al. (2013) Cell 152, 290-303.

通路和蛋白

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