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80283
ALKBH5 (E5Y7C) Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体

ALKBH5 (E5Y7C) Rabbit mAb #80283

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筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1: ALKBH5 (E5Y7C) Rabbit mAb

使用 ALKBH5 (E5Y7C) Rabbit mAb 对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。

购买 # 80283S
产品货号 规格 价格 库存
80283S
100 µl

支持数据

反应性 H M R Mk
敏感性 内源性
MW (kDa) 45-48
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。不要分装抗体。‭

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育,并且轻轻晃动且在室温下孵育 1 小时后,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:263

特异性/敏感性

ALKBH5 (E5Y7C) Rabbit mAb 可识别 AlkBH5 总蛋白的内源水平。预计该抗体可检测所有三种 AlkBH5 同工型。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴

来源/纯化

使用与人 ALKBH5 蛋白中 Gly142 周围残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

N6-甲基腺苷(m6A)是一种丰富且可逆的 RNA 修饰,在 mRNA 剪接、处理和稳定性中发挥重要作用。m6A 的去甲基化是通过两种酶进行的,即脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)和 AlkB 同源物 5(ALKBH5)。ALKBH5 属于 Fe(II)和 2-氧代戊二酸酯依赖性双加氧酶的 AlkB 亚家族,并特异性识别保守结合口袋中的 m6A 修饰(1)。已经显示出 ALKBH5 敲除小鼠是可行的,但是在精子发生中具有缺陷,这主要是由于精母细胞中普遍的凋亡(2)。具体而言,ALKBH5 是精子发生后期减数分裂和单倍体阶段所必需的,而 m6A 去除的缺失会损害关键减数分裂基因的表达所必需的 mRNA 剪接和稳定性(3)。已经显示 ALKBH5 表达在乳腺癌的低氧模型中升高,导致 NANOG mRNA 的 m6A 去甲基化增加,并因此促进乳腺癌干细胞的 NANOG 蛋白表达和积累增加(4)。敲低 ALKBH5 已显示出会削弱 MDA-MB-231 乳腺癌细胞中的肿瘤形成,并且对 ALKBH5 的抑制还可以抑制胶质母细胞瘤干样细胞的肿瘤发生(4-5)。有趣的是,ALKBH5 也可能显示出作为胰腺癌的新型生物标志物的希望,其中表达的增加与更高的总生存率相关(6)。

  1. Xu, C. et al. (2014) J Biol Chem 289, 17299-311.
  2. Zheng, G. et al. (2013) Mol Cell 49, 18-29.
  3. Tang, C. et al. (2018) Proc Natl Acad Sci U S A 115, E325-E333.
  4. Zhang, C. et al. (2016) Proc Natl Acad Sci U S A 113, E2047-56.
  5. Zhang, S. et al. (2017) Cancer Cell 31, 591-606.e6.
  6. Cho, S.H. et al. (2018) Ann Hepatobiliary Pancreat Surg 22, 305-9.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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